小分子Janus 激酶抑制剂的研究与开发
( 沈阳药科大学 基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室，辽宁 沈阳110016)
[ 摘要] 近年来的研究发现，Janus 激酶(JAK) 可通过JAK-STAT 信号通路对细胞增殖、分化、凋亡以及血管生成、免疫调节等起重要作用，其抑制剂可用于骨髓纤维化、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病的防治。简介JAK-STAT 通路与JAK2V617F 突变，分类综述用于治疗恶性血液病和肿瘤以及自身免疫性疾病与移植排斥反应的小分子JAK 抑制剂的研究与开发。
[ 关键词] Janus 激酶；JAK-STAT 信号通路；Janus 激酶抑制剂；肿瘤；自身免疫性疾病
[ 中图分类号]R979.1；R979.5 [文献标志码]A [文章编号]1001-5094（2014）02-0112-08
Research and Development of Small Molecule Janus Kinase Inhibitors
LIAO Gaohong, ZENG Zhengying, CHEN Guoliang (Key Laboratory of Structure-Based Drug Design & Discovery, Ministry of Education, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China) [Abstract] It has been found in recent years that Janus kinase (JAK) could play a key role on the cellular proliferation, differentiation, and apoptosis as well as angiogenesis and immunoregulation through JAK-STAT signaling pathway, and its inhibitors could be used in the prevention and treatment of myelofibrosis, malignant tumors and autoimmune diseases. JAK-STAT pathway and JAK2V617F mutation were briefly introduced.
The research and development of small molecule JAK inhibitors used for the treatment of malignant hempathy, tumors, autoimmune diseases and graft rejection were classifiedly reviewed.[Key words] Janus kinase; JAK-STAT signaling pathway; JAK inhibitor; tumor; autoimmune disease
2005 年有4 个研究小组称，在Ph 阴性骨髓增生性肿瘤（Ph-negative MPN)、真性红细胞增多症（polycythemiavera, PV）、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET) 以及骨髓纤维化(myelofibrosis, MF) 患者体内发现了新的Janus 激酶（JAK）等位基因突变即JAK2V617F 突变，这种突变能诱导激活JAK[1-4]。这一发现不但为上述疾病的病理生理特征研究提供了新的切入点，而且也使JAK 成为可能更有效的治疗靶点[5]。JAK 是一重要的药物靶点，最初JAK 抑制剂被用于治疗MF 这种罕见的恶性血液疾病[6]，随后进一步的研究发现JAK 抑制剂在恶性肿瘤和常见的自身免疫性疾病治疗领域具有良好的应用前景，这也是目前小分子JAK 抑制剂研发的两大方向。
1 JAK-STAT 通路与JAK2V617F 突变
1.1 JAK-STAT 通路
JAK- 信号传导及转录激活因子(signal transduction and activators of transcripition, STAT) 通路是细胞因子信号传导的重要途径( 见图1)，可由多种细胞因子、生长因子以及受体激活，参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管生成、免疫调节等过程，在肿瘤的发生、发展中起重要作用[7]。迄今，在哺乳动物体内共发现4 个JAK 家族成员(JAK1、JAK2、JAK3 及TYK2) 以及7 个STAT 家族成员(STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 及STAT6)。
由图1 可见，细胞因子或生长因子与细胞膜上受体结合后，这些受体首先形成同源或异源二聚体，使胞质内JAK 发生聚集，紧接着邻近的JAK 相互磷酸化而被激活，且促使受体上酪氨酸位点磷酸化而产生与STAT 结合的区域，然后JAK 接近STAT，并使STAT 上一个羟基酪氨酸磷酸化，从而激活STAT，最后活化的STAT 与受体分离，形成二聚体，转位至胞核，与特定的DNA 片段结合，调控基因转录[8]。正常细胞中STAT 的激活是快速而短暂的，而在肿瘤细胞中，STAT 呈持续性激活，导致与细胞增殖、分化、凋亡、侵袭与转移以及血管生成等密切相关的基因表达异常[9-10]。因此，抑制JAK-STAT 通路，即可抑制
STAT 的激活，进而调控肿瘤细胞中异常基因的表达，最终抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡。
1.2 JAK2V617F 突变
JAK2V617F 突变发生于JAK2 基因的1849 位，即原来的鸟嘌呤(G) 被胸腺嘧啶(T) 取代，导致原本617 位的缬氨酸错译编码为苯丙氨酸[11]。目前的诸多研究表明，具有JAK2V617F 突变的细胞中，JAK2 及其信号传导通路下游的STAT5 和蛋白激酶B(Akt) 磷酸化水平升高；JAK2V617F突变除了可通过经典的信号传导通路激活并增强细胞因子诱导的信号级联而调节基因表达，还能通过非经典途径来调节基因转录。Dawson 等[12] 发现，JAK2 存在于人类造血细胞的细胞核中，能直接致使组蛋白H3 的41 位酪氨酸(H3Y41) 磷酸化，而异染色质蛋白1A(HP1A) 可借助染色体阴影域特异性地结合于细胞核内组蛋白H3 的这一区域，然后通过表观遗传学机制介导基因沉默，由JAK2 诱导的H3Y41 磷酸化则能阻止这种结合。另有研究显示，抑制白血病细胞中JAK2 的活性，能降低H3Y41 磷酸化水平，间接促进HP1A 与组蛋白H3 的特异性结合，最终促使致癌
基因沉默[13-15]。
2 用于治疗恶性血液病和肿瘤的小分子JAK 抑制剂
2.1 已上市或准备申请上市的相关药物
2.1.1 Ruxolitinib Ruxolitinib(1) 是美国Incyte 公司开发的一种选择性JAK1 和JAK2 抑制剂，2011 年获美国FDA 批准，成为首个专门治疗MF 的药物[5]。研究表明，该药具良好安全性，对非靶器官无毒性；且除了对MF 具有显著疗效外，其对多种血液疾病也有良好的治疗作用。临床研究显示，MF 患者使用该药治疗32 个月后，总生存率达69%，且经该药长期治疗后，脾肿大症状明显改善[16]。目前，该药用于原发性和继发性红细胞增多症及ET 治疗的Ⅲ期临床研究正在进行中，用于继发性MPN、急性骨髓性白血病(AML)及银屑病的治疗研究均已进入II 期临床试验阶段，且用于其他白血病、前列腺癌和多发性骨髓瘤（MM）的治疗也在研究中[17]。临床研究显示，18 例AML 患者接受该药治疗后，3 例有明显的疗效反应，均达到完全缓解，且血球计数显著改善[18]。
2.1.2 Lestaurtinib Lestaurtinib(CEP-701，2) 系吲哚咔唑衍生物，是Cephalon 公司研发的一种口服抗肿瘤药，为强效JAK2 和FMS 样酪氨酸激酶3 (Fms-like tyrosine kinase3，FLT3) 抑制剂，对野生型和JAK2V617F 突变型JAK2均有抑制作用，并能抑制FLT3 的自磷酸化反应。该药于2006 年获美国FDA 授予的孤儿药身份，用于治疗AML。研究发现，近33% 的AML 患者有FLT3 基因突变，且此基因突变与AML 复发率升高和患者存活率降低有关。一项针对复发型AML 患者的II 期临床研究结果显示，和仅使用化疗相比，患者在化疗后再接受该药治疗，在42d 内肿瘤达到完全消退的比率显著增加(46% vs 27%)。此外，该药用于严重性MM 治疗的研究已进入II 期临床试验，JAK2V617F 突变型MM 病人在接受该药（80 mg，bid）口服治疗后，其中27％的临床症状明显改善[19]。而该药用于前列腺癌以及年轻的复发/ 难治性高风险神经母细胞瘤患者的治疗研究也已进入Ⅰ期临床试验阶段[17]。
2.1.3 SAR302503 SAR302503(3) 是赛诺菲公司开发的一种选择性JAK2 抑制剂，对肿瘤细胞具有抗增殖和抑制生长的活性，在许多实体肿瘤细胞系中能阻断白介素-6（IL-6）信号通路的传导。2013 年5 月赛诺菲公司宣布，基于强有力的后期临床研究数据，准备提交本品用于MF 治疗的上市申请[20]。该公司声称，在一项涉及MF 患者的本品Ⅲ期临床试验中，以脾脏体积缩小不超过35% 的受试者比例作为主要疗效指标，结果，本品2 个剂量(400 和500mg) 治疗组均达到了主要疗效指标[21]；并且这项临床研究被美国FDA 授予特殊临床方案评估资格，即该临床研究数据可用作支持申报的资料；如果本品获得批准，将与Ruxolitinib 展开竞争。该公司还强调，眼下正在开展一项针对使用Ruxolitinib 无效或无法忍受的MF 患者的本品II期临床研究[5]。
2.2 处于早期临床研究阶段的相关化合物
2.2.1 BMS911543 BMS-911543(4) 是百时美- 施贵宝公司开发的强效选择性JAK2 抑制剂，对JAK2 信号依赖的细胞系显示出强效抗增殖活性，而对依赖于JAK1 和JAK3等其他信号途径的细胞类型几乎无抑制作用。而且本品对于使用JAK2V617F 阳性MPN 患者身上获得的初级祖细胞处理过的血液细胞群，也显示抗增殖的作用[22]。与体外研究结果相一致，在小鼠体内JAK2 信号模型研究中，本品也显示出高活性，其经口给药后，能持续性抑制JAK2 信号通路。本品用于MPN 治疗的研究已进入临床Ⅰ期试验，且本品被当作工具药用于MPN 以及其他依赖JAK2 信号通路的疾病病理学研究[23]。
2.2.2 Pacritinib Pacritinib(SB1518 , 5) 是由Cell Therapy Ltd.(CTL) 公司开发的JAK2 和FLT3 抑制剂，对野生型和突变型JAK2 均具有抑制活性，而对JAK1 和JAK3 无明显抑制作用。临床前实验显示，在小鼠原B 细胞Ba/F3 中，本品能降低JAK2 介导的STAT3 和STAT5 磷酸化水平；在小儿急性淋巴髓单核细胞白血病MV4-11 细胞中，本品能降低FLT3 和STAT5 的磷酸化水平；且本品能明显减少Ba/F3-JAK2V617F 突变型肿瘤模型小鼠肝脾肿大的发生[15]。在一项Ⅰ期临床研究中，21 名MF 患者在接受6 个不同剂量(100~600 mg·d-1) 的本品治疗，有4 人的脾肿大缩小了50%，且各剂量组受试者体内STAT3、STAT5 和JAK 的磷酸化水平均得以有效抑制。目前，基于疗效和毒性数据，选择400 mg·d-1 剂量本品用于MPN 治疗的Ⅱ期临床研究正在进行中[5]。
2.2.3 CYT387 CYT387(6) 是加拿大制药公司YM BioSciencesInc.(YMI) 开发的一种JAK1、JAK2 和TYK2 抑制剂，目前Gilead Sciences 公司正着手收购该公司，并打算提供资金用于开展该化合物治疗MPN 的Ⅲ期临床研究[24]。在Ph 阴性MPN 模型小鼠中进行的实验显示，使用该化合物治疗，虽然还不能完全抑制肿瘤发生，但导致肿瘤发生率显著降低，并能不同程度地致使模型小鼠体内许多炎性细胞因子水平下调，包括多种白介素、表皮生长因子、血管生长因子、肿瘤坏死因子-α 和干扰素-γ 等。目前，该化合物用于MF 和MPN 治疗的Ⅰ / Ⅱ期临床研究正在进行中[5]。
2.2.4 AZD1480 Ioannidis 等[25] 研究发现，一系列4-(3- 氨基吡唑) 嘧啶类化合物是JAK-STAT 通路的强效抑制剂。并对通过生物化学和细胞分析方法筛选得到的此类化合物AZD1480(7) 进行了临床前研究，结果显示，该化合物对JAK1 和JAK2 具有良好的选择性抑制活性，且药动学性质优异；以改变剂量的方式考察其对TEL-JAK2 阳性白血病小鼠模型的药效学效应时，模型小鼠无明显的体重下降或其它不良反应发生，且单剂量为30 mg·kg-1 时，其抑制STAT5 磷酸化的时间超过12 h。这些临床前研究数据表明，该化合物具有一定的成药性。目前，该化合物用于MF 治疗的研究已进入Ⅰ期临床试验阶段。
2.3 处于临床前研究阶段的相关化合物
2.3.1 1,2,4- 三唑并[1,5-a] 吡啶类化合物 Dugan 等[26] 研究发现, 一系列1,2,4 - 三唑并[1,5-a] 吡啶类化合物（8~16）具有JAK 抑制活性，其中通过一系列结构修饰而得到的化合物8（CEP-33779) 为强效JAK2 选择性抑制剂。构效关系研究表明，此类化合物结构中，C8 位芳环有对位取代，且取代基为甲磺酰基时，化合物的活性最佳；苯环上取代的饱和杂环从对位移至间位，化合物对JAK2 的选择性增强，其中N- 甲基哌嗪杂环的存在可提高化合物对细胞的亲和力，改善化合物基本骨架的理化常数，并提高化合物的口服生物利用度。CEP-33779 在小鼠体内显示出良好的选择性JAK2 抑制活性和口服生物利用度，在多个JAK2依赖的肿瘤异种移植和炎症模型小鼠中也表现出抗肿瘤和抗炎作用。
2.3.2 噻吩并吡啶类化合物 Schenkel 等[27] 围绕噻吩并吡啶类化合物上可与JAK 相互作用的苯环和酰胺取代基团进行结构改造，得到一系列高选择性JAK2 抑制剂化合物（17~28），它们对JAK2 的选择性分别是对JAK1、JAK3和TYK2 的 100、400 和500 倍，其中2 个代表性化合物17 和23 更是显现出高活性和上佳的药动学性质。这些噻吩并吡啶类化合物不但可作为研究工具，用于深入探索该类化合物对JAK 家族的选择性，而且可用于进一步研究JAK2 的活性位点。
2.3.3 吡唑并[1,5 -a] 嘧啶类化合物 Hanan 等[28] 通过对吡唑并[1,5-a] 嘧啶类化合物中酰胺和嘧啶环上取代基团进行结构修饰，获得一系列选择性JAK2 抑制剂化合物（29~36）。其中，代表性化合物29 具有良好的药动学特性和对JAK2 的高抑制活性(Ki =0.10 nmol·L-1)，在体内能激活STAT5 信号通路，且口服有效，所以被当作合适的研究工具用于此类药物靶向JAK2 的相关药效学研究。目前，该化合物用于PV 和AML 动物模型的临床前研究已在进行中。
2.3.4 1- 氨基-5H- 吡啶并[4,3-b] 吲哚-4- 甲酰胺类化合物Lim 等[29] 经对1- 氨基-5H- 吡啶并[4,3-b] 吲哚-4-甲酰胺类化合物基本骨架上多个取代基进行结构修饰，得到具有潜在JAK 抑制活性的系列化合物（37~43）。其中，代表性化合物37 对JAK2 具有选择性的纳摩尔级抑制活性，且口服有效。进一步的构效关系研究表明，该类化合物结构中，1 和7 位取代对化合物活性影响最大，其中，1位为(R)-1- 环丙基-2,2,2- 三氟乙胺基团取代，是化合物与JAK 实现空间优势结合和产生细胞活性的关键，而7 位上2- 氨基嘧啶基团的存在避免了化合物可能产生与药效无关的非靶效应，如无此基团取代的化合物可能对HERG钾通道和P450 酶具有抑制活性。化合物37 在3 个临床前动物试验中都显现出良好的体内靶向性和药效反应。
3 用于治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的小分子JAK 抑制剂
3.1 已上市的相关药物
Tofacitinib(44) 是辉瑞公司研发用于治疗自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的一个强效JAK 抑制剂，于2012年11 月获美国FDA 批准，以商品名Xeljanz 上市，用于治疗对甲氨蝶呤应答不充分或不能耐受的中至重度类风湿性关节炎(RA) 成年患者，其成为过去10 年来首个获准用于治疗RA 的该类口服药物，目前此类药物的研究与开发仍处于初始阶段。Tofacitinib 的药效靶点是JAK3，JAK3的表达局限于淋巴细胞，主要存在于基因突变的免疫抑制患者体内，但该药对JAK3 的选择性未达到超过对JAK2的100 倍的预期值，只表现出对整个JAK 家族的选择性。不过，由于该药具有良好的药动学性质，临床上已证明其
作用于JAK2 所带来的副作用( 如贫血等) 具有可控性。根据美国FDA 的批准声明，该药的获批附带了风险评估和降低策略(REMS)，强调了与该药治疗相关的严重风险，并要求辉瑞公司对该药开展上市后的进一步研究。该药虽在美国获准上市，但2013 年4 月欧洲药品监管机构(EMA)引证了其风险与潜在收益的对比情况，拒绝了其上市许可申请[30]。目前，Tofacitinib 用于多个不同适应证的临床研究尚在进行中，如用于干眼病和克罗恩病治疗的研究已进入Ⅰ / Ⅱ期临床试验[31-32]。在该药用于预防同种异体肾移植所致急性排斥反应的Ⅱ期临床研究中，随机选择的331例有低至中度免疫风险的肾移植患者使用该药治疗1 年后，肾功能明显改善，且安全性良好[33]。在另一项Ⅱ期临床试验中，银屑病患者使用该药治疗后，其病变严重度呈药物剂量依赖性下降，且在治疗14 d 后，最高剂量组（80mg·d-1）中有3/8 的受试者几乎痊愈 [34]。在又一项为期8周的Ⅱ期临床试验中，溃疡性结肠炎患者分别接受剂量为0.5、3、10 和15 mg（bid）的本品治疗后，治疗反应率分别为32％、48％、61％和78％，低密度和高密度脂蛋白胆固醇水平呈药物剂量依赖性增加，有3 位受试者的中性粒细胞绝对计数明显改善[35]。
3.2 处于临床研究阶段的相关化合物
3.2.1 LY3009104 LY3009104(INCB28050，45) 是礼来公司开发的选择性JAK1/ JAK2 抑制剂，其对JAK1 和JAK2 的IC50 为6 nmol·L-1，而对JAK3 或其他激酶的IC50 均大于600 nmol·L-1。且临床研究证实，该化合物作用于JAK3所引起的副作用可通过调节剂量加以控制。临床前研究显示，LY3009104 在浓度小于50 nmol·L-1 时，能抑制多种促炎细胞因子（包括IL -6 和IL-23）的信号传导；在大
鼠和小鼠关节炎模型中，该化合物均能产生JAK1/JAK2 抑制活性和疗效，且无体液免疫抑制作用或血液不良反应[36]。目前，LY3009104 用于类风湿关节炎治疗的研究已进入Ⅱ期临床试验阶段[37]。
3.2.2 VX-509 VX-509( 结构未公布) 是Vertex 制药公司开发的一个具口服活性的小分子选择性JAK3 抑制剂，早在2011 年9 月该公司就宣称，其口服用于治疗风湿性关节炎的Ⅱ期临床研究达到了主要疗效指标。有204例风湿性关节炎患者参与的中期临床试验结果显示，与安慰剂组相比，本品4 个剂量组（25、50、100 和150mg·d-1) 中2 个高剂量组（100 和150 mg·d-1）受试者在接受治疗12 周后，其体征、症状和疾病活动度显著减轻。基于这项试验结果，该公司又进行了为期6 个月的中期临床研究，进一步评估本品的临床疗效，但其研究数据尚未公布。与同类药物tofacitinib 相比，本品不会造成中性粒细胞减少[38]。鉴于本品在一系列临床试验中的良好治疗效果和安全性以及潜在的巨大市场前景，其进一步的临床研究正在积极进行中。
3.2.3 GLPG0634 GLPG0634( 结构未公布) 是Galapagos 公司开发的一种用于治疗类风湿性关节炎的选择性JAK1抑制剂，其对JAK1 的选择性高于tofacitinib。早在2012年2 月，雅培公司承诺，支付13.5 亿美元预付款，从Galapagos 公司获得GLPG0634 的全球开发许可。后来，雅培公司又与Galapagos 公司达成协议，若Galapagos 公司完成GLPG0634 用于治疗克罗恩病的Ⅱ期临床研究，将支付5 000 万美元[39]。在测试GLPG0634 对177 种激酶和99 种G- 蛋白偶联受体的作用时发现，本品对JAK1 的选择性较对其中174 种激酶高30 倍，而对各G- 蛋白偶联受体则均无明显作用。临床前研究显示，本品的抗类风湿关节炎作用呈剂量依赖性。所有已报道的本品用于类风湿性关节炎治疗的Ⅰ / Ⅱ期临床试验结果显示，与其他抗类风湿性关节炎药物相比，本品的疗效更优，且安全性良好，副作用很少，其所有受试者均完成了试验，症状明显改善，并无贫血反应和血脂异常发生[40]。
Galapagos 公司一直以GLPG0634 对JAK1 的高度选择性为傲，这也是雅培公司收购本品的最大理由，目前本品更大规模的临床研究正在进行中。
3.2.4 R348 与R333 R348 和R333( 结构均未公布) 是Rigel公司开发的小分子JAK3/Syk(spleen tyrosine kinase，脾酪氨酸激酶) 抑制剂，其中R348 是R333 的一种前药，可在肠道和肝脏转换生成活性代谢产物R333 而发挥作用。R348口服后在体内的消除半衰期较短，而R333 的Tmax 延后，Cmax 可持续稳定数小时，半衰期更长，药动学性质更好[41]。临床试验显示，R348 可有效地减少器官移植后的急性排斥反应，且与他克莫司联用具有良好的协同作用；其不损害肾功能，也不升高胆固醇水平，无tofacitinib 所具有的贫血等不良反应。R348 在用于干眼病治疗的Ⅰ期临床研究中呈现出良好的疗效和耐受性，其用于该适应证的Ⅱ期临床研究也随之展开，预计2014 年1 季度可公布研究数据。此外，R348 用于盘状红斑狼疮治疗的研究也进入Ⅱ期临床试验阶段[42]。
4 结语
从恶性肿瘤到自身免疫性疾病等多种疾病中，细胞因子都起着关键性作用，因此JAK 抑制剂极有可能对这些疾病具有不同程度的疗效。研究表明，多种激酶靶向药物用于治疗许多疾病，尤其是那些由多种细胞因子诱导产生的疾病时，均能产生良好疗效，且并不一定会造成较大副作用，如多激酶抑制剂对肿瘤的治疗非常有效；而另一方面，虽然目前对于选择性JAK抑制剂的作用机制及疗效不甚明确，但高选择性的JAK1、JAK2、JAK3 和TYK2 抑制剂可能会有效减少因作用于其他JAK 家族成员而引发的不良反应。因此，选择性JAK 抑制剂已成为目前的研究热点，且有理由相信，随着多激酶抑制剂和高选择性JAK 抑制剂研究的不断深入，其在各类疾病治疗领域的应用必将更加广泛。
2017年8月5-6日，何玉先老师与您不见不散！
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