在5月1日劳动节这天，勤劳的科学家们又在抗癌领域有了新的发现！在当天更新的《自然 生物技术》杂志上，匹兹堡大学医学院的研究人员发表研究，他们利用CRISPR-Cas9将癌细胞中具有特异性的“融合基因”中的特殊序列替换为“自杀基因”，让肿瘤“自爆”，成功缩小了肝癌和前列腺癌小鼠模型的肿瘤，显著提高了患癌小鼠的生存率[1]！
对于这个新研究，匹兹堡大学病理学系高通量基因组中心主任，同时也是研究的通讯作者，Jianhua Luo教授表示：“这是首次使用基因编辑来特异性靶向癌症融合基因。我们对此感到非常兴奋，因为这可能为一种全新的癌症疗法奠定了基础。”[2]
Jianhua Luo教授
Luo教授是一位优秀的华人科学家，他曾就读于广州医学院，目前是匹兹堡大学医学院的医生和病理学教授。过去的十几年中，Luo教授一直致力于研究前列腺癌和肝癌的遗传及分子机制，发现了几个与两种癌症有关的基因和关键的信号通路。Luo教授也是使用甲基化阵列和全基因组甲基化测序来分析前列腺癌的第一人[3]。
想要了解Luo教授的新研究，我们首先要知道一个非常重要的概念：融合基因。它指的是一些本来应该“没有交集”但却异常地“连接”在了一起的基因，这类基因会具有与“融合”前不同的功能，产生促进癌症发生和发展的异常蛋白质。
在2014年的研究中，Luo教授和他的团队发现了一组与前列腺癌有关的“融合基因”，研究中有91%的患者携带其中一种或者几种，它们的存在导致已经全部切除病灶的患者在术后不久就经历了复发和转移[4]。而在今年的早些时候，Luo教授又证实，之前发现的融合基因中的一个——MAN2A1-FER在其他几种癌症，包括肝癌、卵巢癌和肺癌中也同样存在，使得肿瘤能够快速生长和转移[5]。
在新的研究中，除了MAN2A1-FER，研究人员还锁定了另一个目前在前列腺癌中特异性存在的融合基因TMEM135-CCDC67。有了两个目标基因还远远不够，他们还要确定融合基因的“断裂点（breakpoints）”，断裂点其实就是两个基因在发生融合时“相结合”的位置（一段碱基序列）。找到合适的断裂点后，研究人员就可以把“自杀基因”插入其中，然而肿瘤对此“一无所知”，悄无声息地就“一命呜呼”了！
TMEM135和CCDC67基因形成“融合基因”及断裂点示意图
那么“自杀基因”究竟是如何工作的呢？首先，需要将某些细菌或病毒的基因导入靶细胞中，这些基因能够表达相应的酶，催化本来无毒的前体药物（prodrug）转化为细胞毒物质，这样，携带基因的细胞就会被“毒”死了。这次研究中所使用的“自杀基因”是编码HSV1-tk的基因，HSV1-tk是单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase），它所对应催化的前体药物是更昔洛韦（ganciclovir，GCV）。
在这次的设计中，研究人员利用CRISPR-Cas9技术将HSV1-tk的编码基因插入到融合基因的断裂点位置，催化注射入体内的更昔洛韦转化为细胞毒物质，抑制DNA的合成，癌细胞就会加速凋亡了！而且由于“融合基因”只存在于癌细胞中，所以这种方法的特异性是很高的。
为了验证这一点，研究人员在体外创建了两种前列腺癌细胞系（PC3和DU145），然后分别给两个细胞系中的一部分人为导入TMEM135-CCDC67断裂点。通过对比，他们发现，有断裂点的细胞死亡率要明显高得多，而缺少断裂点的细胞即使暴露在高浓度的更昔洛韦中，也不会有大量的死亡。这说明，更昔洛韦对癌细胞的杀伤力是具有“断裂点依赖性”的。
两个细胞系暴露在不同浓度的更昔洛韦中，细胞的死亡率，蓝色和红色为有/无断裂点的PC3细胞系，紫色和绿色为有/无断裂点的DU145细胞系
接下来，研究人员将两种细胞系中培养的癌细胞分别移植给了小鼠，移植3周后，小鼠体内的肿瘤达到了约700mm3，然后研究人员对小鼠们进行了分组治疗。同时转进了包含gRNA、Cas9和HSV1-tk编码基因的腺病毒的小鼠肿瘤缩小了30%，而其余对照组的小鼠肿瘤迅速增长，增大了近40倍！在8周的观察期中，几个对照组的小鼠肿瘤发生转移，相继死亡，而治疗组小鼠完全相反，既没有出现转移，也没有死亡。
PC3（左）和DU145（右）细胞系肿瘤大小随时间变化的对比（点击可看大图）
在验证了前列腺癌小鼠后，研究人员又培养了肝癌细胞系（HUH7和HEP3B），同样把它们移植给小鼠，在移植后2周，肿瘤达到244mm3的时候，给小鼠进行治疗。和前列腺癌小鼠类似，接受包含gRNA、Cas9和HSV1-tk编码基因的腺病毒治疗的小鼠肿瘤缩小了29%，在8周内也同样没有出现转移和死亡。
接受包含gRNA、Cas9D10A和HSV1-tk编码基因的腺病毒治疗的小鼠（蓝）和对照组小鼠（红）的存活率对比
Luo教授打比方说，“其他类型的癌症疗法是针对癌细胞军队中的‘士兵’，而我们的方法是直接瞄准‘指挥中心’，这样敌军的士兵就没有办法‘集结’起来。”即使出现新的“突变”，研究人员仍然可以靶向新出现的“融合基因”，进行持续的治疗[2]。
尽管在这次的研究中，研究人员只是观察到了肿瘤缩小，但Luo教授表示，这只是这种全新抗癌方法的开端，他们下一步的研究将专注于如何改良能够“根除”肿瘤，而不再仅仅是减小。
参考资料：
[1] Zhang-Hui Chen, Yan P Yu, Ze-Hua Zuo, JoelB Nelson, George K Michalopoulos, Satdatshan Monga, Silvia Liu, George Tseng,Jian-Hua Luo. Targeting genomic rearrangements in tumor cells throughCas9-mediated insertion of a suicide gene. Nature Biotechnology, 2017; DOI:10.1038/nbt.3843
[2] http://www.upmc.com/media/NewsReleases/2017/Pages/novel-gene-editing-.aspx
[3] https://www.omicsonline.org/editor-profile/Jianhua_Luo/
[4] Yan P Y, Ding Y, Chen Z, et al. Novel fusion transcripts associate with progressive prostate cancer[J]. The American journal of pathology, 2014, 184(10): 2840-2849.
[5] Chen Z H, Yan P Y, Tao J, et al. MAN2A1–FER Fusion Gene Is Expressed by Human Liver and Other Tumor Types and Has Oncogenic Activity in Mice[J]. Gastroenterology, 2017.
