提到前沿生物学，很多人会觉得与我们的生活毫不相关。但实际上，前沿生物学就如同当今的“物联网”一样，不再是一个遥不可及的概念，而是能够真正改变人们生活的前沿技术。
随着国家对生物医药产业的重视和对基础研究的不断投入，中国与欧美发达国家在生物医学领域的差距正在逐渐缩小，尤其是在诸如小核酸制药、CAR-T疗法、CRISPR基因治疗等前沿生物学领域，中国更是已经走在世界前列，“核酸制药”、“生物医疗”等新兴概念也开始越来越多地出现在人们的视野中。尽管总体上中国的生物医学仍然落后于发达国家几年甚至十几年，但这股强劲的发展势头，已经开始为人们的生活带来意想不到的变革。
强势崛起的小核酸制药
小核酸药物是一种利用小核酸分子实现对受试者体内特定靶基因表达进行调控的基因治疗药物，其原理是利用特定的递送方式将一段十几到几十个碱基的单链或双链小核酸分子导入组织中的靶细胞内，沉默或修饰与小核酸分子具有同源序列的靶基因表达。小核酸药物能够从mRNA水平上调控蛋白的形成，因此理论上能够靶向任何感兴趣的靶点。
目前主要的小核酸药物开发平台有反义核酸平台、siRNA平台和miRNA平台等。
反义核酸平台
反义核酸平台是发展历史最久，也是成果最多的平台。目前全球已上市和临床在研反义核酸药物已达38种，包括去年9月上市的杜氏肌营养不良（DMD）治疗药物Eteplirsen和12月上市的脊髓性肌萎缩（SMA）治疗药物Spinraza。Spinraza被认为是第一个重磅小核酸药物，有望挽救数以万计的SMA儿童患者的生命，同时为开发公司带来数十亿美元的回报。
siRNA平台
siRNA平台是目前发展最快的小核酸制药平台，虽然暂时还没有相关药物上市，但临床上已有30多种siRNA药物处于在研状态，其中4种已进入临床Ⅲ期，分别是Alnylam的Patisiran、Quark的QPI-1007和QPI-1002、以及Sylentis的SYL1001。其中，QPI-1007在国内市场由Quark与瑞博生物合作开发，这是国内第一个获得临床批件的小核酸药物，而世界上第一个siRNA药物则有望在2018年上市。
miRNA平台
miRNA平台的开发进程相对较缓，目前有7种miRNA药物处于临床研究阶段，其中开发进展较快的是Regulus的RG-012和Roche的Miravirsen，二者目前均处于临床Ⅱ期。miRNA平台的多靶点特性既使其在肿瘤治疗领域表现出极大的发展潜力又往往是其快速推进的障碍因素。
国内方面，瑞博生物等从事小核酸药物研发的生物公司正引领着中国的小核酸制药行业快步向前。瑞博生物与美国Quark等国际合作也使得中国的小核酸制药企业更多地走出国门，列入国际小核酸制药行业的第一梯队。由于种种历史原因，国内的小核酸制药行业主要以siRNA平台为主，反义核酸平台与国外领军企业尚有一定差距。不过就在今年4月，瑞博生物与反义核酸制药行业的领头羊——美国Ionis签署战略合作协议（详见瑞博公众号文章：瑞博生物启动与全球核酸制药巨头美国Ionis 的战略合作），合力推动小核酸药物在中国的研发商业化，此举也一定程度上弥补了国内企业在反义核酸制药平台上的短板。
此外，昆山彭济凯丰等专注于miRNA平台的生物公司也在着力推动着国内miRNA平台的发展进程。至此，随着小核酸时代的来临，这一前沿科学比历史上任何时候都更贴近于人们的生活，关乎着人们的健康。
在争议中前行的CRISPR
CRISPR系统是一种革命性的基因编辑技术，它通过短单链引导RNA（guide RNA，gRNA），基于碱基互补配对原则靶向识别基因组或转录组中的目标位点，并通过Cas9、Cpf1或C2c2等具有核酸酶活性的蛋白将基因组相关位点切断并使之在基因修复中引入不同程度的缺失或插入从而改变基因的表达特征或实现目标靶基因的编辑。CRISPR系统最经典的应用是结合CRISPR/spCas9系统用于基因敲除，后续随着功能蛋白的不断发现，出现了多种CRISPR系统，如Cpf1和C2c2，并且基于蛋白结构的解析，通过对其工程化改造，使得CRISPR技术得到了更广泛的应用，如dCas9、fCas9、espCas9等。
目前除了DNA水平基因敲除、替换、插入等基础编辑方式，该技术还可以用于基因表达激活与抑制、RNA编辑等基因操作。
基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术
中国一直都走在CRISPR基因编辑技术的前沿。2013年，中科院周琦等人利用CRISPR/Cas9首次在大鼠上实现多基因同步敲除；2014年，南京大学黄行许等人利用CRISPR/Cas9首次在非人灵长类中实现定向基因突变；2016年10月，四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授领导的团队，将CRISPR基因编辑的T细胞注入了转移性非小细胞肺癌患者体内，实现了CRISPR技术的首次临床应用。
领导首例人体CRISPR临床实验的四川大学华西医院肿瘤学家 卢铀教授
不过就在今年5月30日，Nature Methods上的一篇通信文章却再一次将CRISPR推到了风口浪尖，使得饱受伦理争议的前沿技术再次面临脱靶效应的挑战。该研究工作指出，目前广泛使用的基因编辑技术CRISPR/Cas9可能存在严重的脱靶效应，能够导致小鼠体内产生大量的非预期脱靶突变，包括上百种插入缺失突变和上千种点突变。如果这一研究结果被证实，无疑将会给CRISPR技术的临床应用造成难以估量的负面影响。
该研究在采用CRISPR-Cas9技术成功地修复小鼠胚胎中一种导致失明的Pde6b基因突变后，进一步通过全基因组测序发现两只实验鼠中都存在脱靶效应造成的非预期基因突变，其中一只小鼠（F03）出现了164个插入或缺失突变和1736个点突变，另一只小鼠（F05）则出现了128个插入或缺失突变和1696个点突变。更加严重的是，采用现行的预测方法预测的前50个潜在脱靶位点在实际检测中无一出现，表明目前的脱靶预测方法存在很大的弊端。
Nature Methods公布的CRISPR系统脱靶数据
此文一出，业内一片哗然，尽管CRISPR系统可能存在脱靶效应是学术界的共识，但在以往的研究中，的确很少有研究者使用全基因组测序来评估CRISPR的脱靶效应，也从未认为其脱靶效应有可能如此严重。
该文章一经发表后，学术界就出现了不同的声音，除了大量公众号的转载和评论外，比较多的是来自业界人士的质疑，其主要争议在于该文的实验数据不足，对照组设计不合理等。比如Xiaoli Wu就在Pubmed上发表了一封措辞强硬的comment，严重质疑该研究实验设计的合理性和数据的准确性（目前该comment已删除）；而主攻CRISPR基因编辑的生物医药公司Editas Medicine也迅速发文反驳这一结果，其首席技术官Vic E. Myer与著名科学家Gorge M Church联合发文，称该研究的实验设计和数据解释不足以支撑作者得出的结论（这一文章目前刊登在Church实验室网站上）。
除此之外，也有研究人员开始试图探究造成CRISPR大范围脱靶的作用机制和应对措施，比如有研究者通过同源性分析推测可能有某些序列和二级结构与gRNA骨架相似的非编码RNA充当了“内源gRNA”的角色，从而引起大范围脱靶。
目前，全球范围内至少已有几十个课题组表示计划或已经开展了该研究类似的脱靶验证工作，相信真相很快就会水落石出。
Editas Medicine的首席CTO与Church的联合发文
小核酸与CRISPR的脱靶
历史总是惊人的相似，小核酸在发展历史上也受到过脱靶效应的质疑。从原理上讲，小核酸与CRISPR具有一定的相似之处，他们都需要一段与靶基因互补的短序列和一个执行切割作用的酶或酶复合物。小核酸中与靶基因互补的序列长度通常为16-30 nt（主要为16-23nt），而CRISPR的gRNA中，除去通用骨架部分的gRNA scaffold，负责与靶基因碱基互补的guide sequence序列通常为20nt。两者用于互补配对的碱基长度相似，因此可能具有相似的脱靶现象。
CRISPR系统的gRNA结构
然而由于作用机制的不同，小核酸药物的目标只是将靶基因的表达量敲低，在发生脱靶时，碱基的错配会使得脱靶基因的IC50比靶向基因的IC50高数倍甚至数个量级，因此可能不会对脱靶基因造成严重的影响，并且小核酸药物的基因敲低效应通常是可以逆转的，在停药后一般能够恢复。
更主要的是，随着近年来小核酸产业对技术平台的整体改进，以及序列设计、递送方法、化学修饰和药物活性上的优化，脱靶效应已基本可以避免，不再是制约小核酸产业发展的瓶颈了。
对于CRISPR系统而言，由于它是直接将目标靶基因进行插入、缺失或者点突变，且一旦发生，则难以逆转。所以在技术应用，尤其是临床应用时需要非常谨慎地判断其潜在的脱靶效应，因为脱靶一旦发生，很有可能会带来灾难性的后果。
不过需要指出的是，目前临床（前）研究中采用的CRISPR技术一般是充分考虑过脱靶问题的，比如通过筛选更优的gRNA、改良Cas9蛋白以提高特异性、使用更低的Cas9和gRNA浓度来降低脱靶效应等。此外，我国和美国即将进行的CRISPR临床试验都不是直接在受试者体内应用CRISPR系统，而是将受试者的T细胞取出，在体外用CRISPR/Cas9系统敲除PD-1基因后，通过相关安全性评价，再重新导入患者体内，这也在很大程度上削弱了脱靶效应带来的潜在风险。
因此，笔者对CRISPR的临床应用前景仍然保持审慎的乐观，毕竟，任何基于事实的质疑都有其独特的价值，而每一次争议最终都会促进技术的进步和完善。
小核酸制药已经开启了一个新的时代，而CRISPR的大规模临床应用似乎也不再那么遥远，如今的前沿生物学正越来越多的走出实验室，为守护人们的生命和健康带来革命性的力量。“21世纪是生物的世纪”这个承诺了近一代人的梦想似乎终于要走进现实了。
参考资料：
1. http://www.biomedtracker.com/
2. Schaefer, K. A., et al. (2017). "Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo." Nat Methods 14(6): 547-548.
3. http://arep.med.harvard.edu/pdf/Schaefer_Opinion_2Jun2017.pdf
4. https://zhuanlan.zhihu.com/p/27232020
