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何玉先
中国医学科学院艾滋病研究中心主任、研究员，北京协和医学院协和学者特聘教授、博导。国家杰出青年基金获得者。主要从事艾滋病的分子病毒和免疫学、抗病毒药物研究。
以gp41为靶点的HIV-1多肽膜融合抑制剂研究进展
丁晓慧，何玉先
（中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所）
摘要：HIV-1 进入抑制剂是继逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂后的第三代抗 HIV 药物，该类药物能抑制 HIV-1 进入靶细胞，从而在最初环节抑制病毒的传播。近年来，随着对膜融合过程分子机制及 gp41 功能研究的不断深入，新的以 gp41 不同功能区为靶点的多肽膜融10合抑制剂分子不断被发现，成为倍受关注的研究热点之一。本文着重对近年来以 gp41 为靶点的 HIV-1 多肽膜融合抑制剂研究进展进行综述。
关键词：HIV；gp41；膜融合抑制剂
中图分类号：R37
引言
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症（Acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）感染引起的一种严重的慢性传染性疾病，以全身免疫系统严重损害为特征。根据联合国艾滋病规划署 (UNAIDS)报道，截止到 2014 年，世界范围内 HIV/AIDS 患者约有 7000 万，而艾滋病病毒携带者约 3690 万 ，HIV-1 已严重威胁到人类的生命安全。自 1987 年第一个抗 HIV-1 的药物-叠氮胸苷获得美国FDA 批准使用后，越来越多的抗 HIV 治疗药物开始进入大众的视线，包括核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及融合/进入抑制剂等。1996 年，美籍华裔科学家何大一提出高效抗逆转录病毒治疗法，即“鸡尾酒疗法”，即通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病，该疗法的应用极大的改善了患者的生活质量并减少了相关发病率及死亡率。然而，病毒耐药株的出现以及因使用该疗法而产生的毒副作用使得新型抗 HIV 药物研究成为当务之急，新的抗 HIV 药物靶点成为研究热点。
HIV-1 进入抑制剂是继逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂后的第三代抗 HIV 药物，该类药物能抑制 HIV-1 进入靶细胞，从而在最初环节抑制病毒的传播，主要包括：阻断 gp120与 CD4 连接的粘附抑制剂；干扰 gp120-CXCR4 或 gp120-CCR5 相互作用的辅助受体拮抗剂；直接作用于 gp41 介导的膜融合抑制剂。近年来，随着对膜融合过程分子机制及 gp41 功能研究的不断深入，新的以 gp41 不同功能区为靶点的多肽膜融合抑制剂分子不断被发现，成为倍受关注的研究热点之一。本文着重对近年来 HIV-1 多肽膜融合抑制剂的研究进展进行综述。
1、 HIV-1 进入机制
HIV-1 进入靶细胞的过程依赖于病毒表面的包膜糖蛋白 gp120 及 gp41。当病毒侵染靶细胞时，首先是包膜糖蛋白表面亚基 gp120 与靶细胞膜的 CD4 受体结合，gp120 构象发生变化，暴露出其与辅助受体结合位点；随后，gp120 再与靶细胞表面的辅助受体(CCR5 或CXCR4)结合，导致其与跨膜亚基 gp41 分裂；最后，gp41 的构象发生改变，启动病毒包膜与靶细胞膜的融合，完成病毒进入宿主细胞的过程。而这一过程中gp41 作为介导 HIV-1 与靶细胞膜融合的关键性蛋白，是融合抑制剂作用的重要靶标。 gp41 由融合肽 (fusion peptide，FP)、胞外区、跨膜区（TM）等构成（图 1），在其胞外区内存在两个与膜融合密切相关的螺旋结构功能区，即 N 末端重复序列 (N-terminal heptad repeat，NHR) 和 C 末端重复序列 (N-terminal heptad repeat，CHR)。膜融合过程中，3 个 NHR 形成位于中心的三聚体复合螺旋核，而 3 个 CHR 以反向平行的方式分别结合到 3 个 NHR 作用形成的疏水性沟槽内，由此相互作用形成一种六螺旋体核心结构(six-helix bundle，6-HB)，使得两种膜相互接近，最终发生融合。 gp41 6-HB 分子结构的发现为其作为药物靶标奠定了基础。
2、C 肽类 HIV-1 膜融合抑制剂
C 肽即衍生于 gp41 CHR 片段的多肽，以 gp41 NHR 三聚体 (N-trimer) 为作用靶标，是目前研究最多也是最具药物研发前景的 HIV-1 融合抑制剂（图 1）。
T-20（Enfuvirtide，DP-178，商品名 Fuzeon）是由 Roehe 和 Trimeds 公司联合开发的抗HIV 新药，于 2003 年 3 月 13 日在美国上市，是第一个被 FDA 批准的融合抑制剂，主要用于对 HIV-1 感染常规治疗药物产生耐药性的患者。该多肽衍生于 gp41 CHR 的第 638～673位氨基酸，由 36 个氨基酸残基组成。由于缺少 NHR Pocket 结合区（PBD)，因此 T-20 无法与 NHR 作用形成稳定的 6-HB，同时也无法抑制其他多肽之间 6-HB 结构的形成。文献报道指出，与 NHR 的相互作用并不是 T-20 发挥抗病毒活性的唯一机制。研究发现，来自 gp41 跨膜区的多肽及 gp120 辅助受体结合位点的多肽均能显著抑制其抗病毒活力，这表明，T-20介导的抗病毒活性是通过与多个靶点相互作用实现的。临床实验研究表明，T-20 能够有效减少血浆病毒载量，增强 HIV-1 感染患者的免疫状况，具有很好的安全性和耐受性，对成人及儿童患者均适用。然而，其体内生物利用度低，药动学性质较差，使用不便 (皮下注射, 一天两次)，合成成本高，同时随着该多肽药物的多次使用，耐药毒株不断出现，限制了 T-20 的进一步使用。
T1249 是由 Roehe 和 Trimeris 公司开发的继 T-20 后第二代多肽类融合抑制剂，为一个嵌合序列 39 肽，由 HIV-1、HIV-2 以及猿免疫缺陷病毒 (SIV) CHR 区域相关序列构成。与 T-20 相比，其 N 端增加了与 NHR Pocket 结合序列。尽管 T1249 的活性比 T-20 高出一个数量级，体内药动学性质较好，而且对 T20 耐药株也表现出高抗病毒活性，但由于经费和市场的问题，T-1249 的临床研究已于 2004 年停止。
T1144 作为 Trimeris 公司推出的第三代多肽类 HIV-1 融合抑制剂，其作用位点与 T-20 完全不同，主要含 Pocket 结合区，作用于 NHR Pocket 疏水性口袋。该多肽含 38 个氨基酸残基，是通过对天然 CHR 序列 T651 (C38: aa 626-673) 进行修饰，引入能够稳定 α-螺旋结构的丙氨酸以及由正负离子对相互作用形成的盐桥，进一步增强序列的 α-螺旋性及与 N 肽形成 6-HB 的稳定性，同时改善药代动力学性质。研究结果表明，T1144 能够显著抑制 T-20 耐药性毒株，同时比 T-20 显示了更高的抗病毒活性及更好的药代动力学性质。
Sifuvirtide (西夫韦肽) 是天津扶素生物技术有限公司开发的属于第三代 HIV-1 多肽融合抑制剂， 是一个 36 肽，通过对天然 CHR 多肽 C34 序列引入盐桥及稳定螺旋残基提高其稳定性及抗融合活性。 Sifuvirtide 以 NHR Pocket 疏水口袋区为其主要作用靶点，其效价明显高于 T-20，并且对 T-20 耐药毒株有很好的抑制效果，目前已进入 III 期临床试验阶段，有望成为第二个临床应用 HIV-1 融合抑制剂。
He 等发现 CHR 多肽 Pocket 结合区上游的两个氨基酸残基 Met626 与 Thr627 能形100成一个独特的 M-T 钩子结构，其能极大的提高 CHR 多肽与 NHR Pocket 的结合能力及抗病毒活性，这一发现为 HIV-1 多肽膜融合抑制剂的设计或优化提供了一个新的思路。随后，在 M-T 钩子基础上设计的短序列多肽如 MT-SC22EK（图 2），HP23及 2P23等，不仅序列短、结构稳定、与 NHR 结合能力强、 抗病毒活性高，同时由于这些多肽主要由 M-T 钩子及 Pocket 结合区组成，成功避开了大多数耐药位点，同时由于 Pocket 序列的高度保守性，也不易诱导新耐药位点的产生，有望进入临床试验阶段。
3、N 肽类 HIV-1 膜融合抑制剂
N 肽即衍生于 gp41 NHR 序列的多肽，也是最早被发现具有抑制 HIV-1 融合活性的多肽，DP-107 (aa: 558−595) 是第一个被发现具有抗融合活性的多肽。其可能的作用机制有两种:一是通过与 CHR 结合抑制 6-HB 结构的形成；二是与 NHR 作用形成异源三聚体从而破坏自身 NHR-trimer 结构的形成。尽管 N 肽显示了一定的抗病毒活性，但与 C 肽115相比，它们的活性很低，同时由于单一的 N 肽溶解性差且容易自身聚集，因此，对 N 肽的研究主要集中在克服上述缺陷方面。
Shai 等对 N36 的 N 端进行不同长度的脂肪酸修饰，结果发现其抗 HIV-1 融合活性得到显著提高，且抑制活性随脂肪酸链长度的增加而增加，这表明类似于 C 肽，将 N 肽锚定到靶细胞膜上也能显著提高其抗病毒活性。同时发现，将脂肪酸连接到 N36 C 端得到的结果与 N 端结果相差不大，表明脂肪酸链长度与活性密切相关，但是肽链的方向性对其活性发挥并不重要。进一步的分析表明 C16-N36 并非以 CHR 为作用靶标，而是主要通过与NHR 作用而发挥抑制活性。随后 Shai 等对另一短序列多肽 N27 进行同样的脂肪酸修饰，结果发现将脂肪酸连接到 N27 的氨基端能显著提高其抗病毒活性，而连接到羧基端反而对其抗病毒活性无明显影响。进一步分析发现 N27 主要通过与 CHR 发生相互作用来抑制病毒侵染，这表明脂肪酸连接的方向性取决于多肽的作用靶标，只有将多肽定位到正确的位置方向上，才能有力的发挥其抗病毒活性。
4、以 gp41 融合肽（FP）为靶标的融合抑制剂
FP 是位于 gp41 跨膜糖蛋白氨基端，由大约 23 个氨基酸残基组成的高度疏水区域，在 HIV-1 进入靶细胞过程中扮演重要角色。 膜融合初期，HIV-1 包膜糖蛋白表面亚基 gp120 分别与靶细胞表面 CD4 受体和辅助受体 CCR5/CXCR4 结合后，导致 gp41 的构象发生改变，其 N 端 FP 暴露出来，插入宿主细胞膜并锚定其中，开始启动膜融合过程。 Kirchhoff 等通过对血液透析液分离鉴定，发现了一种可以阻断 HIV-1 病毒感染的天然成分，即病毒抑制肽(Virus inhibitory peptide，VIRIP)。该多肽由 20 个天然氨基酸残基组成，通过与 FP 特异性结合，阻断 FP 锚定到靶细胞膜，从而抑制膜融合的启动。通过对 VIRIP 进行结构改造及修饰，研究者设计合成了一系列类似物，并在其中发现了若干含二硫键的肽序列，活性VIRIP 提高了两个数量级，达纳摩尔水平，且没有细胞毒性。同时研究发现，FP 区域具有高度保守性，HIV-1 病毒对 VIRIP 产生耐药性突变的几率甚小，为研发全新的抗 AIDS药物带来了希望。
5 、结论
以 gp41 为靶点的 HIV-1 融合抑制剂是一种新型的抗 HIV 药物，与另外两种进入抑制剂相比，由于 gp41 的序列比 gp120 更加保守稳定，所以具有较好的抗耐药性。而 T-20 的发现开辟了利用肽类药物控制 HIV-1 进入靶细胞的新领域。尽管由于其自身的一些缺陷及不足限制了 T-20 更广泛的应用，但是，由于膜融合是 HIV-1 进入靶细胞的关键步骤，因此，融合抑制剂的研究，不仅能够提供新的抗 HIV 感染化合物，而且研究结果有利于进一步明确膜融合的分子机制以及揭示 gp41 在膜融合状态下的实际结构，进而产生新的理论和思路，指导理性的融合抑制剂设计。目前，对于新型膜融合抑制剂研究，C 肽仍然是研究最多的药物，而重点在于克服 T-20 耐药性及多肽类药物在体内的稳定性，而这也必然成为今后研究的主要方向。
（参考文献略）
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本文是何玉先教授就“以gp41为靶点的HIV-1多肽膜融合抑制剂研究进展”精彩解读，《第二届中国药物发展与合作泰达论坛》会议上我们将继续有幸聆听何玉先教授对“强效HIV膜融合抑制剂的研究与开发”专题解读，2017年8月5-6日何教授与您不见不散。
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