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两性霉素B发酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施

马亦蓉

上海上药新亚药业有限公司

上海 201203


摘  要:两性霉素B的发酵工艺入手,介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程,通过分析可能造成发酵染菌的原因,结合实际情况,确定了发酵染菌的主要原因,并制定了相应的控制措施,改进后的染菌情况大为改观。

关键词:两性霉素B;发酵染菌;原因;染菌率;措施

 

0  引言

虽然两性霉素B含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类抗生素,是治疗全身性深度真菌感染的唯一有效药物,但其副作用大、毒性大,而两性霉素B脂质体能有效弥补这一缺陷。作为两性霉素B脂质体的原料来源——两性霉素B,采用生物合成法(微生物发酵法)生产,利用两性霉素B的产生菌,在一定的条件(包括培养基、温度、pH、通气、搅拌等)下使其生长繁殖,并在代谢过程中产生两性霉素B,再用溶媒结晶法将两性霉素B从发酵液中提取出来,加以精制,最后获得两性霉素B成品。

两性霉素B的生产工艺(菌种→孢子制备→种子制备→发酵)属于发酵生产工艺。然而,发酵生产工艺要求,除大量繁殖两性霉素B的产生菌外,不允许其他杂菌(即染菌)的生长。染菌不仅消耗培养基中的营养成分,还会分泌某些对产生菌有毒性或者能使两性霉素B失去活性的物质。同时,降低两性霉素B的发酵单位,严重时会导致“倒罐”,即发酵过程中出现了较为严重的染菌现象,意味着发酵失败。因此,防止染菌,降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。

本文从多方面入手,分析可能造成两性霉素B发酵染菌的原因,并通过制定相应的措施,降低染菌率。

 

1  发酵生产简介

1.1  工艺流程

两性霉素B的发酵工艺流程如图1所示。

1.2  设备流程

两性霉素B的发酵设备流程如图2所示。

1.3  关键工艺简述

将节状链霉菌(Str. nodosus)培育至生产菌株,需经种子阶段、发酵阶段的通气培养,培养基由葡萄糖等原料作为碳源、酵母粉等原料作为氮源,并添加微量元素,整个培养繁殖过程应保持严格的纯种状态。

在整个发酵过程中,需全程进行杂菌试验,以此来判断发酵过程是否染菌。通过观察菌种外观、镜检等手段来判断从一级发酵进入二级发酵(移种)的时机。两性霉素B经过发酵周期后,发酵液经酸化过滤,收集滤饼(两性霉素B菌丝体)。

 

2  染菌事件的调查

两性霉素B发酵生产中发生了染菌事件,通过调查发现,其均为二级发酵间歇染菌,调查结果如表1所示,染菌情况严重,造成发酵效价低,过滤困难,只能作“倒罐”处理。

注:(1)J表示正常,无染菌;L表示已染菌;(2)染菌率=染菌批次/总批次×100%。

从表1可以看出:12批两性霉素B发酵的染菌率为50%,染菌情况严峻。

 

3  染菌原因分析及要因确认

两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认如表2所示。

两性霉素B发酵生产的染菌事故调查中,经过染菌原因分析及要因确认后,汇总并制成染菌原因鱼刺分析图,如图3所示。

 

4  采取的控制措施

根据两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图,针对引发染菌的主要原因,制定相应的控制措施,如表3所示。

4.1  空气系统中水分过多

总空气过滤器的失效多数是由空气系统中水分过多造成,若不能有效除湿,过滤介质极易失效,引起污染。针对这一情况,应落实专人负责空气系统的管理,定期检查,定时消毒,及时放出冷凝水,并对空气在进入总过滤器之前加热升温,使得相对湿度下降,然后进入总空气过滤器除菌,尽可能减少空气系统中的水分。

4.2  罐体渗漏

对发酵罐进行大范围检修,在罐体内电焊捉漏,检查夹套是否腐蚀穿孔,检查管道和连接部件安装是否合理;对罐壁、电焊缝渗漏处作相应处理,严密堵漏。

4.3  罐内设计不合理

(1)针对空气分布口偏高,影响发酵液吸收溶氧的情况,应降低空气分布板位置,使分布口高度适宜,使发酵液有效吸收溶氧。

(2)针对罐内出料管道口距罐底距离过大,影响发酵罐清洗,从而造成发酵罐染菌的情况,应把原来高度在100 mm左右出料的管道口改为基本接近罐底。

(3)针对排汽管道细,排汽不流畅,出现死角的情况,应清理旋风器,增加排汽出口,减少排汽死角。

4.4  蒸汽供应压力低或不稳定

蒸汽供应的压力稳定是保证发酵系统有效灭菌的基础。若蒸汽压力不稳定,就会因为灭菌不彻底造成污染;若蒸汽压力低,就会造成灭菌时间长,进而破坏培养基。

一般蒸汽由动力车间供应,因此,应保证足够压力的饱和蒸汽及其稳定性。

4.5  灭菌操作不到位

(1)为了提高相关操作人员的素质,应对操作人员进行SOP教育培训,并进行考核;(2)强化管理,严格要求员工按照岗位SOP操作,认真控制预热温度、罐温及维持罐内培养基温度,严格控制进料流量,保证灭菌质量;(3)抽查操作人员的工作情况,并与工资、奖金挂钩。

4.6  工艺弱点

针对消毒时液面高的现象,可提高某培养基使用比例,降低另一培养基使用比例,使消毒液面得以有效控制。

 

5  效果检查与对比

在针对两性霉素B的染菌主因,制定并落实了相应的控制措施后,染菌情况大为改观,染菌率直线下降,具体效果如表4所示。图4为改进前后两性霉素B的平均效价对比,图5为改进前后两性霉素B的染菌率对比。

注:(1)J表示正常,无染菌;L表示已染菌;(2)染菌率=染菌批次/总批次×100%。

从表4可以看出:12批两性霉素B发酵的染菌率为8.33%,染菌问题大有改观。 


6  结语

本文从两性霉素B的发酵工艺入手,介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程,通过分析可能造成发酵染菌的原因,结合实际情况,确定了发酵染菌的主要原因,并制定了相应的控制措施,改进后的染菌情况大为改观。

同时,建议采取以下巩固措施:

(1)制定管理标准,加强对设备等的定期检查力度,每月进行检查、维修,发现问题及时解决;

(2)修正工艺规程,并写入标准操作规程;

(3)制定岗位培训计划,对员工定期进行各项规章制度、岗位操作规程及相关文件的培训,并严格遵照执行。

 

[参考文献]

[1] 陈裕充,温海.两性霉素B及其脂质体的抗真菌机制[J].中国真菌学杂志,2006,1(5):312-314.

[2] 王以光.抗生素生物技术[M].北京:化学工业出版社,2009:26-28.

[3] 熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京:中国医药出版社,1995:38-40.

[4] 马寅姣,宋沁馨,顾觉奋.抗生素筛选方法[J].中国抗生素杂志,2010,35(9):654-658.

[5] 贺娟.一株产大环内酯类抗真菌抗生素菌株的鉴定及发酵工艺优化[D].杭州:浙江大学,2011.

 

作者简介:

马亦蓉(1971—),女,上海人,工程师,从事药品生产工艺与质量管理工作。


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