动物药材分子鉴别现状与策略
黄璐琦1*，袁媛1，蒋超1，田晓轩2
(1.道地药材国家重点实验室培育基地，中国中医科学院 中药资源中心 北京 100700；2.天津中医药大学 天津300193)
[摘要] 笔者于2011年提出的动物药分子鉴定的策略与目标已初步完成，即先后提出中药分子鉴定原则、研制推出动物药材分子鉴定试剂盒、发展中国动物药材DNA条形码及其标准鉴定数据库。本文在此基础上，进一步对近5年动物药材分子鉴别的科研、技术、产业化发展现状与问题进行总结，提出进一步加强动物分类学基础研究、扩大研究品种，完善基础数据库建设，针对关键技术难点开发更为有效、快速的检测方法，促进标准制定或修订和产业化发展等策略。
[关键词] 动物药材；分子鉴定；关键问题；核心技术
动物药材在中医药行业中具有重要地位，《中华人民共和国药典》2010版(以下简称《中国药典》)收载了蕲蛇、乌梢蛇的特异性PCR鉴别方法，成为中外药典收载的第一个中药分子鉴定方法，标示着DNA鉴定手段已从实验室进入了广泛应用阶段[1]。2011年作者曾对动物药材分子鉴定研究的现状及问题进行了总结和分析，并提出扩大研究品种、加快动物药材分子鉴定试剂盒的研制和推广，全面启动动物药材DNA条形码研究计划，建立动物药材分子鉴定标准数据库等研究策略等[2]。在过去的5年里，随着分子生物学技术的发展和分子鉴定理论不断完善，中药分子鉴定原则的提出，中国动物药材DNA条形码的发展与分子鉴定数据库的建立，相继研制推出了蕲蛇、乌梢蛇、冬虫夏草等动物药材分子鉴定试剂盒，表明2011年提出的动物药分子鉴定的策略与目标已初步完成。目前已通过DNA分子标记鉴定的动物药材包括土鳖虫、地龙、蜈蚣、水蛭等虫类；蛤壳、珍珠母等介类；金钱白花蛇、乌梢蛇、蛤蚧等蛇蜥类；龟甲、穿山甲、鹿茸、鹿角、羚羊角、鳖甲等角甲类；阿胶等胶霜类；麝香、蛇胆等囊胆类；桑螵蛸等外分泌物类药材以及海龙、海马等海洋药物(详见表1)。动物药材DNA分子鉴定技术开始呈现多样性，鉴定范围从属、种鉴别扩大到居群、品种与产地，检测材料也从原动物、药材、饮片扩大到中成药，鉴定需求正在逐步从定性检测向定量检测方向发展。
1 动物药材分子鉴定关键问题
1.1 动物分类学基础及分子鉴定标准化
动物药材的分子鉴定，首先依赖于对其原动物进行准确的分类学鉴定。然而不同种类动物的分类学研究进展存在严重的不平衡，如相对于鸟类、兽类等大型动物，昆虫等无脊椎动物的分类研究进展缓慢，导致其物种的区分、鉴定和命名工作远未完成。加之世界范围传统分类学研究人员的缺乏，且如不具备相关形态学经验，仅依靠检索表难以完成动物的准确分类鉴定，也造成部分动物药材的原动物分类基础薄弱。
另一方面，在获取标准动物药材之后，还需采取标准化手段建立动物药材分子鉴定方法。以动物通用条形码标记COⅠ为例，根据国际生命条形码数据标准，每个DNA条形码都要有完整的凭证标本信息、采集信息和测序峰图的原始文件，且应及时上传生命条形码数据系统(BOLD，http：//boldsystems.org/)和/或GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)数据库。而事实上，早期分类学研究团队发表的数据常不能严格执行以上要求，导致后续以此类研究为基础的动物药材分子鉴定工作，存在假阳性或假阴性可能。
目前在已完成《中国药用动物志》的基础上，中国动物药材DNA条形码研究计划制定了统一的“药用动物DNA条形码试验样品采(收)集规范”，以及实验研究基本路径和实施方案；通过各协作组专家、同仁的齐心努力，已顺利完成了蛇类、蛤蚧类、哈蟆油类、龟甲类、水蛭类、海马类、鱼类、虻虫类、桑螵蛸、斑蝥、鹿茸类、羚羊角类等十二大类正品及其伪混品之分子系统学及COⅠ和或/CytbDNA条形码鉴定研究，以期为动物药材准确、快速鉴定奠定理论与技术基础。
1.2 种下水平鉴定问题
与植物药类似，在动物药(如阿胶)中同样存在道地药材鉴别、野生与家养品鉴别等难题。而目前最为通用的动物DNA条形码技术是物种水平鉴定的工具，其分子标记的选择可有效区分同属近缘物种。而针对种下水平(如不同地理居群、品种与产地)，随着高通量测序技术普及，可依赖基因组(包括线粒体基因组)、转录组数据，设计开发新的分子标记。且细胞器基因组本身，也有望作为“超级条形码”，解决快速分化的近缘物种鉴定问题[3]。
表1部分代表性动物药材DNA分子鉴定汇总
药材品种技术备注内容简述参考文献阿胶特异性PCR药材基于驴、马、猪、牛的SINE序列差异开发了一对驴特异性PCR引物,仅驴皮胶能产生约80bp条带[4]鳖甲特异性PCR原动物比较山瑞鳖、缘板鳖、斑鼋、中华鳖12S序列,设计特异性引物,55℃退火下仅正品有扩出320bp条带[5]鳖甲DNA条形码原动物比较了GenBank上中华鳖、山瑞鳖、缘板鳖等的COⅠ序列,各物种可形成相对独立的分支[6]鳖PCR-RFLP种系太湖、黄河、台湾、日本品系中华鳖NADH4、COXI和NADH5-NADH6扩增产物酶切图谱均不相同[7]龟甲特异性PCR药材通过比较龟甲原动物乌龟及其18种混伪品12S序列,设计了一对龟甲特异性PCR引物扩增乌龟及其他18种龟的DNA模板,正品乌龟均可获得180bp特异性条带,混伪品无条带[8]龟甲DNA条形码原动物以COⅠ为条形码构建系统发育树,龟甲基原动物形成独立一支与其他8种常见伪品相互区分[9]冬虫夏草定量PCR药材比较正品及古尼虫草等ITS序列,设计冬虫夏草特异性反应的实时荧光PCR引物和探针,检测限低至0.1pg[10]冬虫夏草LAMP药材针对冬虫夏草的CS2基因设计环介导等温扩增(LAMP)引物组,65℃时恒温反应1h,可特异性鉴别冬虫夏草及其6种常见混伪品,其检测限达6pg·mL-1[11]冬虫夏草PCR-RFLP药材利用ITS基源的一个SNP位点,设计引物并进行PCR-RFLP分析,冬虫夏草可被SacⅡ酶切形成488bp和128bp的两个条带,伪品古尼虫草无法酶切[12]
表1(续)
表1(续)
2 动物药材分子鉴定研究现状
目前中药分子鉴定技术，较为公认的方式有3类[62-63]：(1)DNA扩增指纹，如AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增长多多态性)、RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat，简单重复序列间区多态性)以及由之派生出的SCAR(Sequence-Characterized Amplified Region，序列特异性扩增区)等；(2)分子杂交信号，如Southern杂交及DNA芯片技术等；(3)核酸序列分析，如DNA测序、DNA barcoding技术(DNA 条形码技术)、AS-PCR(Allele-Specific PCR，位点特异性PCR技术)、HRM分析(High Resolution Melting，高分辨率熔解曲线分析)以及派生出的依据序列差异进行区分的各种新型扩增与检测方法等，这些方法多已应用于动物药材分子鉴定。
2.1 DNA扩增指纹技术
系指使用通用引物对基因组进行扩增，通过扩增条带差异进行检测(RAPD,AFLP,DAMD,SSSR等)或对扩增条带进行后续处理(RAPD-SCAR等)以鉴定中药的技术，如通过RAPD技术依其条带差异鉴别中药材海龙[29]以及从RAPD中转化出虫草特异性的SCAR鉴别冬虫夏草[13]等。DNA扩增指纹技术只要筛选通用引物即可鉴定，不需要待测物种的基因组信息，能在短时间内筛选大量位点信息，尤其适合于物种及以下分类阶元的鉴定；鉴定过程可无需DNA测序，成本较低。主要缺陷包括引物较短(9~10bp)，DNA聚合酶、扩增体系、反应条件等变化都可能影响实验重复性，最终影响鉴定结果。同时由于扩增指纹是一种随机扩增技术，不区分目标序列与外源污染物，而微生物易滋生的特点致使其在动物药鉴定中应用困难。近年来随着DNA序列的积累和基于特异性序列鉴别技术的发展，DNA扩增指纹技术在动物药鉴定日渐减少，但对种下遗传多样性分析和居群鉴定方面仍有一定优势，亦有选择重现性好的特异性条带进行测序转化为SCAR标记进行动物药鉴定的研究。
2.2 分子杂交信号技术
系指将待测单链核酸与已知序列的单链核酸序列通过碱基配对形成可以检测的双螺旋片段，通过靶序列凝胶电泳图谱差异(Southern杂交)或固定在固相基质上不同位置的探针分子杂交信号(DNA芯片杂交)进行鉴定的一种技术，其中DNA芯片杂交因其探针密度大、检测方便等优势广泛用于物种鉴定。如Geoffrey等根据常见肉类16SrRNA序列差异设计特异性探针点制于芯片上，通过PCR扩增含探针序列的16S区域后在芯片上进行杂交，可同时鉴别牛、羊、猪、马等32种肉类，混伪检出限可达1%[64]。DNA杂交技术最大的优势是中到高通量的信息位点集成，能同时检测混合生物样本中的多个组分，利于掺杂检测，结合探针短，可用于部分降解的材料，并且根据不同探针标记类型可鉴定未知遗传背景(如SSH杂交，Suppression Subtraction Hybridization[65])和已知遗传背景的物种，适合的分类元可从种上到种下(如DArT芯片，Diversity Arrays Technology[66])；但与基于PCR的方法相比，DNA分子杂交技术耗时长，且较松弛的杂交条件可能产生交叉杂交而导致假阳性[62]，同时探针筛选和条件确定工作量大，由于目标DNA只与特定的探针结合，对于中高通量芯片来说物料消耗大，成本高。目前DNA分子杂交技术在植物药和食品鉴定中研究较多，还未见有动物药DNA分子杂交技术的研究报道。近年来DNA条形码研究积累了大量物种序列信息，针对条形码上序列变异信息设计特异性探针点制芯片，通过样品条形码片段扩增后进行芯片杂交和荧光信号分析从而进行物种鉴定，从而依据科属制作全物种鉴定芯片表现出一定优势[67-68]。
2.3 核酸序列分析技术
核酸序列是遗传信息的直接载体，能直接反映物种的遗传变异从而实现中药的分子鉴别。随着DNA测序技术的发展，测序通量不断增加同时价格大幅下降，利用DNA测序可以获得大量信息标记，进而开发出简单、特异的分子鉴定方法。目前已有多种基于核酸序列分析的鉴定方法。
2.3.1 DNA测序鉴定 指扩增目的基因后对序列进行测序，通过生物信息学分析判断物种归属的方法。目前DNA测序鉴定中最引人瞩目的方法是DNA条形码技术，该方法通过选择一对通用引物，扩增一段物种间有足够变异、易于扩增、相对较短(～700bp)的DNA片段，测序后通过特定的生物信息学方法与构建的DNA条形码数据库进行比对从而鉴定物种。与其他的鉴定方法相比，DNA条形码最大的特点是通用性，并且易于实现数据共享构建全球统一的数据库进行鉴定，在动物物种鉴定中尤为成功。《中国药典》2015版收载的中药DNA条形码鉴别指导原则即为本法。
自Pual Hebert等[69]对包括脊椎动物和无脊椎动物11门13320个物种的线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(CytochromecosdaseⅠ，COⅠ)基因序列比较分析提出DNA条形码概念以来，COⅠ作为动物通用DNA条形码已获得公认，我国全面启动动物药DNA条形码计划时间较晚[1，70]，研究尚处于初级阶段，许多动物药并未测定DNA条形码数据；对药典中45个动物药材的51基原物种的COⅠ序列进行了分析，表明除节肢动物门外，其在物种水平和属水平上均能达到准确鉴定[71]。但在部分节肢动物类群中，COⅠ序列在容易产生混伪品的同属近缘物种间，分辨率时而不够理想。除COⅠ外，Cytb、Nad、12SrRNA与16SrRNA序列也有望作为候选条形码或条形码组合进行动物药鉴定。另一方面，对于遗传关系复杂、分类学基础薄弱的物种，依据DNA条形码序列重建的系统发育关系常与已有分类学认知存在不一致，其所揭示的隐存物种多样性，物种间关系争议，需要谨慎细致的个案分析。
2.3.2 特异性扩增鉴定 系指在正伪品差异序列上设计特异性引物进行扩增，利用引物与正品DNA序列完全匹配可进行扩增产生特定长度条带，伪品因引物与序列不匹配发生阻滞无法产生条带从而进行鉴定的一种方法，依据正伪品序列差异大小与引物位置，基于PCR的方法可分为特异性PCR和位点特异性PCR(AS-PCR，Allele-specificPCR)。基于扩增阻滞的原理，改变扩增方法，可实现特异性LAMP(Loop-mediate disotermal Amplification，环介导等温扩增技术)[11]、特异性HDA(Helicase Dependengy Amplification，解旋酶依赖扩增)[72]等其他特异性扩增鉴定方式；改变检测方法，可实现特异性荧光定量PCR鉴定，快速PCR鉴定[17]，荧光共振能量转移(FRET, Forster Resonance Energy Transfer)鉴定[60]，微流控芯片鉴定及DNA试纸条鉴定[15]等；改变扩增体系，特异性PCR亦可组合成多重特异性PCR鉴定，如对蛇类药材[18]、鹿类药材[41]的鉴定。
主要的特异性扩增鉴定方法中，特异性PCR利用正伪品间序列变异大的区域或正品特有序列区域设计引物，因DNA序列差异大，正伪品间遗传间断明显，特异性和稳健性均较好，在动物药鉴定中应用广泛，如阿胶[4]，龟甲[8]，蛤蚧[26]，鸡内金[51]等的鉴定，2010年起《中国药典》收载的蕲蛇和乌梢蛇聚合酶链式反应鉴别即为本法；位点特异性PCR则根据单个SNP变异位点，利用TaqDNA聚合酶缺少3′～5′外切酶校正活性，当引物3′ 端与混伪品错配时造成扩增阻滞无法产生条带从而区分正伪品[73]，已用于冬虫夏草[10]、鹿茸[38]等动物药鉴定。特异性扩增鉴定技术对于任意具有序列差异的物种均可鉴定，高效、快速，操作简便、仪器依赖性低、易于制成试剂盒推广，目前已有蕲蛇、乌梢蛇、龟甲等的鉴定试剂盒面世；该方法的主要缺点是不同中药鉴定引物需单独设计，不利于建立数据库共享，对于一些含有PCR阻抑物的动物药，可能产生假阴性结果，特异性鉴定引物设计时需要大量测序及条件优化工作。
2.3.3 PCR-RFLP鉴定 系指在正伪品差异区域两侧序列设计共有引物进行 PCR扩增，对扩增产物使用合适的内切酶进行酶切，根据酶切条带谱图差异鉴别的一种方法，如对冬虫夏草[11]、金钱白花蛇[23]等药材的鉴定，2012年起《中国药典》收载的川贝母的聚合酶链式反应-限制性内切酶酶切图谱多态性鉴别即为本法。该方法具有良好的重现性和准确性，适合于较低阶分类元尤其是多基源的近缘物种的中药鉴定，与基于测序的方法相比操作简单、仪器依赖性低、易于制成试剂盒推广；PCR-RFLP不足之处主要是要求正伪品差异序列/差异SNP位点位于限制性内切酶的识别位点上，并且其序列差异正好导致酶切能力改变，对于一些具有内切酶阻抑物的动物药，导致酶切不完全，PCR-RFLP引物设计时需要考虑酶切前后片段分离度并且扩增序列内不含有额外的限制性内切酶识别位点。
2.3.4 高通量测序技术 高通量测序技术(High Throughput Sequencing)是测序技术发展的一个里程碑，通过把整个基因组序列片段化后，通过不同手段把DNA片段分散从而使各个片段分离并测序，可以对数百万个DNA分子进行同时测序。目前所说的高通量测序技术主要是指454焦磷酸测序、Illumina及Iontorrent二代测序以及单分子测序技术。高通量测序技术在鉴定上的突出优点是能同时对大量序列进行并行测序，通过生信分析可对基因组、转录组及甲基化组等组学数据进行分析获得大量分子标记，能对未知混合生物样本进行物种解析。如CoghlanML等对牙痛一粒丸等15种中成药trnL内含子和16S rRNA片段的PCR扩增产物进行高通量测序，测序结果进行高通量BLAST比对解析中成药中物种基源，发现标称含有羚羊角的中药存在山羊角序列[57]。
3 动物药材分子鉴别研究发展方向
3.1 鉴定标记和DNA提取方法开发多元化
不同动物药材的来源、炮制、存储、市场销售情况千差万别，不能奢求一种方法满足所有的鉴定需求。例如，由于动物药材含有大量营养成分，在存储、运输、加工过程中易滋生细菌、真菌、寄生虫和仓储害虫。虽然进行DNA提取前处理时常须对动物药材表面进行乙醇擦拭和紫外杀菌处理，但药材内部仍可能藏有细菌、真菌和仓储害虫等，难以避免DNA污染。且对于水蛭、虻虫等吸血性动物来说，其体内可能含有其它物种血液，在使用COⅠ、Cyt b等DNA条形码鉴别方法时，会同时扩增药材及其污染物种基因片段，影响鉴别的准确性。因此，选择专属性高的分子标记是保证动物药材鉴定准确的重要发展方向。
另一方面，由于一些动物类药材如胶类、贝壳类、分泌物、皮膜药材，DNA降解严重或含量较低，造成DNA提取困难、PCR扩增难度也很大；骨骼药材DNA提取时因须进行脱钙处理，用时较长。这些困难也阻碍了分子鉴定技术的推广。针对此类样品，摸索固定最适宜的DNA提取条件，开发短片段分子标记是较合理的解决策略。
3.2 加强标准研究和制定
《中国药典》2015版共收载动物药材50种、其中仅31种载有鉴定方法，而冬虫夏草、海龙、海马、蛇蜕、金钱白花蛇、鹿角、蜂蜜等常用动物药项下无任何鉴定方法(表2)。具有鉴定项的动物药则多以显微和薄层鉴定为主，专属性和特异性不强，仅蕲蛇、乌梢蛇鉴别项下收载PCR鉴定方法。除了《中国药典》以外，有关动物药材及饮片分子鉴定标准重点应加强行业标准、团体标准和企业标准的制定工作，推进技术方法广泛应用。
表2《中国药典》2015版中收载的动物药鉴定方法
编号药材名鉴定项数检查项含量项编号药材名鉴定项数检查项含量项1九香虫薄层11026海龙0002土鳖虫显微1+薄层14027海螵蛸显微1+理化1113瓦楞子00028桑螵蛸显微1304牛黄性状2+薄层23229蛇蜕0105乌梢蛇性状1+PCR10030猪胆粉薄层1416水牛角显微10031鹿角0007水蛭薄层16132鹿角胶质谱1618石决明00133鹿角霜0109冬虫夏草00134鹿茸理化1+薄层10010地龙显微1+薄层26035羚羊角显微10011虫白蜡03036斑蝥薄层10112血余炭01037蛤壳显微1+薄层12113全蝎显微11038蛤蚧显微1+薄层10014牡蛎显微1+薄层12139蜈蚣03015体外培育牛黄性状1+理化*3+薄层12240蜂房03016龟甲薄层10041蜂胶性状1+薄层15117龟甲胶理化1+质谱15142蜂蜡00018阿胶质谱14143蜂蜜06119鸡内金02044蝉蜕00020金钱白花蛇00045蕲蛇PCR10021珍珠显微1+理化22046僵蚕显微15022珍珠母显微1+理化22047蟾酥性状1+理化2+薄层13123哈蟆油液相10048鳖甲00024穿山甲显微1+薄层12049麝香性状3+显微1+液相12125海马03050水牛角浓缩粉031
注：*理化鉴定指通过简单试剂颜色或状态变化检测的方法
3.3 扩大技术推广范围
目前仅在经济较发达地区科研院所、部分省级药检部门、极少数大型医药企业建有动物药材分子鉴定实验室，大部分机构和医药企业不具备动物药材分子检验能力，严重制约了分子鉴定技术的推广应用。随着动物药材分子鉴定技术改良、PCR鉴定试剂盒的商业化生产，逐步解决基础条件薄弱问题，重点加强科研和检验人员队伍建设，增加检验品种数量，扩大技术培训范围，将有力的促进动物药材分子鉴定技术的应用。
4 展望
DNA分子标记作为遗传信息的直接载体，不受外在形态、发育阶段、取样部位和生境差异的影响，在缺乏特征成分的动物药鉴定中体现出明显的优势。DNA序列仅由A、T、C、G四种碱基组成，易于搭建数据库实现数据共享。相对于小分子标记物，DNA标记选取可以应对属、种乃至种下的不同层级，具有特异性高、灵敏度好的特点，且其检测方法可以多向拓展，因而近年来在动物药材鉴定领域得以快速发展。未来动物药材分子鉴定应进一步加强动物分类学基础研究、扩大研究品种，完善基础数据库建设，针对复杂多来源药材和关键技术难点开发更为有效、快速的检测方法(如单碱基延伸及其他信号扩增技术等)，促进标准制定或修订和产业化发展。
参考文献（略）
来源：中国现代中药，2017，19（1）：1-10.
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