高效液相色谱法

一、高效液相色谱法的分类

二、化学键合相色谱法

（一）正相键合相色谱法

正相键合相色谱法采用极性键合相为固定相，如氰基（-CN）、氨基（-NH2）等键合在硅胶表面。以非极性或弱极性溶剂，如烷烃加适量极性调整剂如醇类作流动相。正相键合相色谱主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。

在正相键合相色谱中，组分的保留和分离的一般规律是：极性强的组分的保留因子k大，tR大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小，先洗脱出柱。

（二）反相键合相色谱法

反相键合相色谱法采用非极性键合相为固定相，如十八烷基硅烷（C18）、辛烷基（C8）等化学键合相。

流动相以水作为基础溶剂再加入一定量与水混溶的极性调整剂，常用甲醇-水、乙腈-水等等。

（1）溶质的分子结构：溶质的极性越弱，其与非极性固定相的相互作用越强，k越大，tR也越大。在同系物中，含碳数越多，则极性越弱，k越大。

（2）流动相：极性增加，洗脱能力减弱，使溶质的k增加。

 1)溶剂比例：若增加流动相中水的含量，则溶剂强度降低，使溶质的k值变大。

 2)PH:影响弱酸弱碱的离解。流动相PH降低，弱酸k增大，tR增大。流动相PH降低，弱碱k减小，tR减小。

离子抑制色谱法适用于分析3≤pKa≤7的弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。

（3）固定相：键合烷基的极性随碳链的延长而减弱因此与非极性溶质的相互作用增强，溶质的k增大，tR增大。当链长一定时，硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大，tR也越大。

反相键合相色谱法1)适合分离非极性至中等极性的组分（分离极性小的样品）。2)极性大的组分先流出色谱柱。

（三）反相离子对色谱法

离子对色谱法适用于有机酸、碱、盐的分离，以及离子型和非离子型化合物的混合物的分离。

三、其他高效液相色谱法

一、高效液相色谱法的固定相

（一）常用化学键合相的种类和性质

（1）非极性键合相：十八烷基硅烷（ODS或C18）键合相是最常用的非极性键合相。非极性键合相通常用于反相色谱。

（2）弱极性键合相：可作为正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定。

（3）极性键合相：一般都用作正相色谱的固定相。氰基键合相和氨基键合相是常用的极性键合相。氨基键合相不宜分离带羰基的物质，流动相中也不得含有羰基化合物。使用硅胶基质的化学键合相时流动相中水相的pH应维持在2-8，否则会引起硅胶溶解。

（二）其他种类的固定相

手性固定相（CSP）：分为蛋白类CSP、多糖CSP、环糊精CSP、π-氢键型CSP、大环抗生素类CSP、配体交换CSP

二、高效液相色谱法的流动相

HPLC对流动相的基本要求：(1)化学稳定性好，不与固定相发生化学反应(2)对试样有适宜的溶解度。要求k在1-10范围内，最好在2-5的范围内(3)必须与检测器相适应。例如用紫外检测器时，只能选用截止波长小于检测波长的溶剂(4)纯度要高，黏度要低。低黏度流动相如甲醇、乙腈可以降低柱压，提高柱效。

（一）流动相对分离的影响

在HPLC中，n由固定相及色谱柱填充质量决定，α主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。增加流动相中强溶剂的比例，其洗脱能力增强，使k变小。

（二）溶剂的强度和选择性（了解）

一、高效液相色谱速率理论

1.涡流扩散

2.纵向扩散：在HPLC中，流动相是液体，其黏度比气体黏度大得多（HPLC与GC相比，可以忽略纵向扩散项的主要因素）。而且HPLC的流速一般都在最佳流速以上，这时纵向扩散项很小，可以忽略。

3.传质阻抗

4.固定相颗粒粒度对塔板高度的影响

二、高效液相色谱分离方法选择

（一）正相键合相色谱法的分离条件

（二）反相键合相色谱法的分离条件

（三）反相离子对色谱法的分离条件

（1）离子对试剂的选择：离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反。随离子对试剂碳链长度增加，溶质的k相应增加，tR相应增加。

（2）流动相pH的选择：调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化。

（3）有机溶剂及其浓度的选择：与一般反相HPLC相同，流动相中所含有机溶剂的比例越高，组分的k值越小。

一、高压输液系统

二、进样系统

三、色谱柱分离系统

四、检测系统

（一）检测器的主要性能

按其适用范围，检测器可分为通用型和专属型两大类。

专属型检测器（选择性检测器）：紫外检测器、荧光检测器属于这一类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应。

通用型检测器：示差折光检测器和蒸发光散射检测器。

（二）紫外检测器（专属型、浓度型检测器）

   只能检测有紫外吸收的物质，而且流动相有一定限制，即流动相的截止波长应小于检测波长。

几种常用检测器的主要性能

五、数据记录处理和计算机控制系统