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纳米材料诱导肺部疾病及其机制研究进展
孙小怡 李艳博△ 郭彩霞△
【摘要】：随着纳米科技的飞速发展，纳米材料凭借其独特的理化性能在材料、工业、环保、军事、医药等多个领域扮演着重要的角色。纳米材料的生产和使用，使其不可避免地进入生态系统，人们可通过环境暴露、职业暴露和医源性暴露接触到纳米材料。呼吸系统是纳米材料进入人体的最主要的途径。大量研究证实，吸入的纳米材料主要通过氧化应激、炎症反应和离子紊乱等毒性机制来对肺造成损伤，诱导肉芽肿病变、肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病，甚至肺癌等肺部疾病的发生。本文对纳米材料暴露与肺部疾病的关系及其肺毒性作用机制进行简要综述。
【关键词】：纳米结构；环境暴露；毒性试验；肺疾病；纳米材料；肺毒性
【中图分类号】：R994.6
【文献标志码】：A
【DOI】：10.11958/20160580
【基金项目】：国家自然科学基金项目（81202242，81573176）；北京市自然科学基金资助课题（7162022）；北京市教育委员会科技发展计划面上项目（KM201510025005）
【作者单位】：首都医科大学公共卫生学院（邮编100069）
【作者简介】：孙小怡（1994），女，2013级七年制临床医学在读，主要从事环境毒理方面研究
【△通讯作者E-mail】：guocx@ccmu.edu.cn；ybli@ccmu.edu.cn
1 与纳米材料毒性有关的肺部疾病
肺由气道和肺泡组成。气道是相对坚硬的屏障，纳米材料难以通过有黏液保护的上皮细胞，然而肺泡壁和动脉血管之间的气血屏障则非常薄，这为纳米材料进入肺组织提供了生理学基础［2］。气血屏障难以抵挡外界的刺激，是肺部疾病的好发部位。当纳米材料在肺部的沉积速率大于清除速率时，沉积的纳米材料可能破坏肺泡巨噬细胞介导的清除功能或者延长清除时间，进一步破坏肺上皮细胞，造成一系列的肺部损伤。
肉芽肿病变是炎症细胞集聚和增生造成的慢性炎症反应，能够对肺组织造成损伤，且与其他肺部疾病的发生密切相关。Song等［3］报道的7例18 ~ 47岁年轻女职工胸膜中出现异物肉芽肿，同时伴有纤维细胞和炎症细胞的集聚；电镜观察发现，在死者肺部上皮细胞、面部和手臂等皮肤细胞内可观察到直径约为30 nm的颗粒。实验室研究结合劳动卫生现场调查证实，胸膜中出现肉芽肿的原因是吸入聚丙烯酸酯纳米材料。单壁碳纳米管（single-wall carbon nanotube，SWCNT）、多壁碳纳米管（multi-wall carbon nanotube，MWCNT）等碳纳米材料由于其纤维性状，在肺部因难以清除而持续作用，较早被报道可导致动物肺脏发生肉芽肿反应，同时在肺脏间质可引发肺纤维化反应［4-5］。而且，SWCNT暴露后，肺脏组织和支气管肺泡灌洗液中可见碳桥结构，表现为：SWCNT在少数相邻的2个巨噬细胞之间形成尾端没入细胞质内［6］。体内动物实验研究也发现，除了碳纳米材料之外，纳米四氧化三铁（ferroferric oxide，Fe3O4）、纳米二氧化硅（silica dioxide，SiO2）、纳米二氧化钛（titanium dioxide，TiO2）等纳米材料均可诱导肺部肉芽肿病变［7］。当气管内注入纳米Fe3O4后，无论是14d的短时间还是52周的长时间喷注，小鼠肺部均出现了由吞噬纳米粒子的巨噬细胞、炎症细胞和胶原纤维聚集形成的肉芽肿病变［8-9］。而且，不仅采用气管内染毒的方式，纳米材料诱导肺部肉芽肿，甚至腹腔内注射纳米TiO221d，小鼠肺实质也出现了肉芽肿性病变［10］。
肺纤维化是一种由于持续的炎症反应而产生的进行性、致死性的疾病。研究发现，小鼠经气管内吸入纳米氧化锌（zinc oxide，ZnO）肺内出现了胶原蛋白的累积，即肺纤维化的出现；Song等［3］报道的暴露在聚丙烯酸酯纳米材料环境中工作的年轻女职工出现了肺纤维化，以及上述的碳纳米材料暴露诱导肺组织纤维化的发生等，充分地证实纳米材料暴露可增加患肺纤维化的风险。基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）的失衡在在肺纤维化中发挥了重要的作用。MMPs和TIMP可以控制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和降解，这是组织修复的关键。正常情况下，TIMP的水平远远超过MMPs，抑制了ECM的降解。有研究显示，小鼠腹腔注射纳米二氧化铈（cerium oxide，CeO2）后，肺组织内出现肉芽肿和肺纤维化的病理改变，且肺内MMPs的水平和活性均明显升高，同时，该研究证明，在肺纤维化之前存在肺蛋白沉着症的过渡阶段，通过透射显微镜可观察到肺表面活性物质的积累［11］。纳米材料诱导肺纤维化可能与其引发炎症反应有关，但也存在非炎性细胞损伤，如细胞凋亡。大量研究证实，肺纤维化患者或动物模型中存在大量的肺脏细胞凋亡。细胞凋亡和细胞增殖失调可造成肺脏细胞组成紊乱而引发肺结构紊乱，导致肺脏纤维化的发生［11-12］。近年来研究还发现，上皮间质转化也参与肺纤维化［12］，可能通过TGF-β/Smad［13-14］、TGF-β/Akt/GSK-3β/SNAIL-1［15］等信号通路介导。
哮喘是一种由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR）慢性炎症性疾病，主要特征表现为黏液分泌过多、嗜酸性粒细胞浸润以及强烈的气管反应，临床表现为反复发作的喘息、气急、胸闷或咳嗽等症状。卵蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的小鼠哮喘模型揭示了过敏性哮喘的重要特性，包括嗜酸性粒细胞和Th2细胞因子如白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13等的数量增加，该模型已被广泛用于研究环境因素对哮喘的影响［16］。Huang等［17］的研究证实小鼠经口咽途径暴露纳米ZnO后，嗜酸性粒细胞数量增多，暴露24 h后 IL-4、IL-5、IL-6、IL-13的表达显著增加；Han等［18］在实验中观察到，暴露于纳米SiO2的小鼠出现呼吸困难、气道重塑和IL-4水平升高的现象，而且气道暴露纳米SiO2后，纳米SiO2可作为佐剂增强机体对过敏原的敏感性，促进过敏性气道疾病的发生［19］。这都证实了哮喘的发生与纳米材料暴露密切相关。除诱导哮喘发生外，纳米材料还可加重哮喘疾病。Park等［20］发现鼻内滴注纳米CuO可诱导小鼠气道炎症和黏液分泌，且丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化与其气道毒性密切相关，而且可增强OVA诱导的AHR，增加炎症细胞数量、促炎因子表达和IgE水平，从而加重哮喘；SWCNTs也可加重OVA诱导大鼠过敏性哮喘，但维生素E可拮抗该作用［21］。经查阅文献发现，金属或非金属氧化物纳米材料（如：纳米ZnO、纳米SiO2、纳米TiO2、纳米CuO）、纳米金、纳米银以及SWCNTs等多种纳米材料均被报道可诱发或加重动物哮喘发生［22-23］，主要表现为AHR、气道重塑和气道炎症。不过，纳米材料与哮喘方面的报道结论不一。有研究显示，纳米银可减弱哮喘小鼠的气道炎症和AHR［24］。另外，机体的免疫状态可影响纳米材料对气道炎症的调节作用，影响哮喘的发生［25］。健康小鼠与OVA致敏小鼠相比，当气道反复暴露纳米TiO2后，前者表现为肺部中性粒细胞浸润、趋化因子CXCL5（C-X-C motif ligand 5）表达升高，而后者肺部炎症反应减弱，表现为与哮喘相关的白细胞水平、细胞因子、趋化因子等的表达显著降低。
（COPD） COPD主要是由于气道炎症（如慢性支气管炎）和肺泡上皮的连续性损伤（如肺气肿引起的慢性气道阻塞）所致［26］，其共同特征是管径小于2 mm的小气道阻塞和阻力升高。纳米材料暴露与COPD发生有关。Chen等［27］发现，纳米TiO2可通过增强胎盘生长因子和趋化因子CXCL1、CXCL5、CCL3（C-C motif ligand 3）等的表达，激活炎症通路，造成肺气肿、肺巨噬细胞增生、Ⅱ型肺细胞增生以及肺上皮细胞凋亡，肺泡隔遭到严重破坏。Sadeghi等［28］也发现，小鼠吸入纳米三氧化二铁（Fe2O3）后出现肺气肿、肺间质充血和炎症等。同样，气管内注入50 μg粒径为14 nm的炭黑纳米粒子可加重弹性蛋白酶诱导的小鼠肺气肿，这与促进炎症因子释放有关［29］；但Roulet等［30］的研究却显示，纳米和炭黑纳米粒子不能加重弹性蛋白酶诱导的大鼠肺气肿，实验结论的不一致可能与粒子本身的特性、剂量和动物种属等有关。
肿瘤的发生是遗传与环境交互作用的结果。大量的体内外研究证实，纳米材料具有遗传毒性［31-36］，表现为：诱导细胞或组织DNA损伤、染色体畸变，干扰基因组稳定性。纳米材料对肺细胞的遗传毒性为纳米材料暴露与肺癌的相关性提供了重要的线索［37］。差异基因表达分析结果显示，纳米ZnO暴露可诱导COPD和肺癌患者淋巴细胞中肿瘤抑制基因p53、原癌基因Ras p21和JNKs表达增加，且呈现明显的剂量依赖性，提示纳米ZnO具有遗传毒性和致癌潜能［38］。细胞恶性转化被认为是一种评价外源化合物致癌性的重要体外研究方法。Wang等［39］证实了慢性SWCNTs暴露可促进人肺上皮细胞恶性转化，诱导肺癌的发生，且肿瘤抑制基因p53信号通路参与细胞恶性转化。同时，动物实验发现敲除p53基因的小鼠腹腔注射MWCNTs之后可以观察到间皮瘤的发生［40-41］，这也为p53在碳纳米材料致癌中的作用提供了支持。肿瘤的发生是一个多阶段的过程，分为启动、促进和发展3个阶段，纳米材料暴露究竟作用于哪个环节需待深入研究。不过已有研究指出，纳米TiO2不能诱导Hras128转基因大鼠的皮肤发生癌变，主要是由于纳米TiO2不能穿透表皮，从而不能到达深层皮肤组织内［42］，但可显著促进N-亚硝基二（2-羟丙基）胺诱导Hras128转基因大鼠肺泡细胞增生、肺腺癌的发生［43］。总而言之，纳米材料暴露是否致癌受多种因素的影响，可能与纳米材料的种类、剂量、处理方式、作用时间以及组织和细胞类型等有关。值得一提的是，非纳米级TiO2长期吸入实验中，仅250 mg/m3高剂量组大鼠出现肺肿瘤［44］；而粒径为20 nm的TiO2仅10 mg/m3就可诱导肿瘤发生［45］；同样，纳米钴可诱导体外培养的小鼠成纤维细胞恶性转化，而氯化钴则不能［46］。这反映出纳米尺度材料由于其特殊的理化特性，在致癌方面不同于常规材料，可能表现出更强的致癌性。
2 纳米材料肺毒性相关作用机制
小鼠腹腔注射纳米SiO2之后，在肺部可检测到脂质过氧化物酶（lipid peroxidation，LPO）水平显著升高［47］；腹腔注射纳米TiO2的小鼠肺组织中活性氧（ROS）水平是正常组的3倍［10］；吸入纳米Fe2O3后，小鼠肺组织中ROS水平显著上升而谷胱甘肽水平下降［28］，以上均证实了纳米材料暴露可诱导机体发生氧化应激。氧化应激是纳米材料发挥生物毒效应、损伤细胞的最普遍的机制，其重要性在于可通过氧化应激调节细胞活动，如细胞凋亡、DNA加合物的形成和促炎症基因的表达等［48］。自由基产生系统和清除系统的失衡是氧化应激的主要原因。Wang等［49］认为，纳米ZnO主要是通过产生ROS来抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，发挥其细胞毒作用。
氧化应激主要是通过ROS来实现的。巨噬细胞和中性粒细胞的线粒体是ROS的主要来源［50］，在合成ATP的过程中，呼吸链电子传递异常导致电子漏出，生产大量ROS。在纳米材料表面活化的自由基中间体和功能化的氧化还原活性基团也很有可能是氧化剂的内在来源［51］。此外，对于缺乏表面活性基团的低毒性纳米材料而言，直接或者间接作用于线粒体的生物相互作用是产生ROS的重要途径［52-53］。ROS通过生物膜脂质过氧化反应破坏细胞膜和细胞器膜的完整性，诱导细胞膜通透性增加，影响细胞代谢。ROS也可以与蛋白质氨基酸残基发生氧化反应导致蛋白质结构被破坏，引起酶的活性下降或丧失以及细胞信号转导功能障碍，导致细胞功能障碍［54］、正常组织细胞损伤，引发急性和慢性炎症应答，导致肉芽组织增生和慢性特异性肉芽肿反应，这也解释了纳米材料造成肉芽肿病变、肺纤维化等肺部疾病的原因。另外，氧化应激在肺癌发生发展中发挥重要作用。如有研究表明，纳米TiO2可通过产生ROS将致瘤性差、无转移性的小鼠纤维肉瘤转变为侵袭性强的恶性肿瘤细胞［55］，这可能与纳米材料产生的ROS可导致DNA链断裂和染色体畸变有关［32］。
纳米材料诱导肺部损伤的实验中，常可观察到巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞浸润，以及肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-1β等炎性细胞因子分泌增多，证实了炎症反应的存在。在哮喘、COPD、肺癌等与纳米材料肺毒性相关的肺部疾病中都观察到炎症反应的出现。纳米材料暴露可诱导炎症细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞等浸润，炎症细胞脱颗粒释放组胺、前列腺素、白三烯等炎症介质，导致支气管狭窄、阻塞、黏膜水肿以及黏液分泌过多，这与哮喘和COPD的发生密切相关。另外，巨噬细胞、T淋巴细胞可以释放炎症介质，对肿瘤的形成和迁移有一定的作用。这都表明了炎症反应是纳米材料肺毒性的主要机制之一。虽然Li等［56］采用鼻腔滴注法将小鼠暴露在纳米TiO290d之后，观察到了巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞数量增加的现象，即炎症反应的出现，但是Mohammadi等［10］在小鼠腹腔内注射纳米TiO2之后并没有观察到炎症的存在，这可能与实验中使用的纳米材料大小、形状和来源等不同有关。同时，纳米材料表面修饰影响其促炎作用。有研究显示，非晶型SiO2包被物可以减轻纳米CeO2诱导的肺部炎症［57］。
Th1/Th2细胞失衡与炎症密切相关。文献报道，小鼠气管内滴注纳米TiO2可通过Th2介导慢性炎症反应的发生［58］。而且，氧化应激和炎症反应密不可分。ROS可启动促炎症反应，进而促进与炎症相关的细胞因子、趋化因子和黏附分子的表达。促炎症反应通过激活炎症反应通路MAPK和转录因子核因子（NF）-κB实现。Capasso等［59］证实，在纳米氧化镍（nickel oxide，NiO）致肺上皮细胞毒性的实验中，炎症因子的释放依赖于NF-κB信号通路介导的MAPK级联反应通路的活化。Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的激活也可能与纳米材料引发的炎症反应有关［60］。
除了氧化应激和炎症反应之外，纳米材料引发肺毒性过程中，还有其他机制参与其中。如细胞内Ca2+浓度升高介导的细胞死亡参与纳米材料肺毒性作用。Ca2+是调节细胞凋亡的第二信使，Ca2+的浓度受到离子通道、内质网Ca2+-ATP酶、质膜Ca泵和线粒体Ca2+运输等的调节。纳米材料可通过损伤Ca2+通道，增加细胞器膜通透性，导致细胞内Ca2+超载，从而影响细胞的正常生理功能。Yu等［61］发现，纳米TiO2可以破坏线粒体、内质网膜的完整性，促进ROS释放，进而ROS破坏Ca2+通道相关蛋白三磷酸肌醇受体（inositol triphosphate receptor，IP3R）、电压依赖型阴离子通道蛋白1（voltage-dependent anion-selective channel protein 1，VDAC1）和葡萄糖调节蛋白75（75-kDa glucose regulated protein，Grp75），导致Ca2+超载。当细胞内的Ca2+浓度增加时，Ca2+会被转移到线粒体，启动细胞凋亡或细胞自噬性死亡等信号通路［62］。
3 展望
随着纳米科技的发展，纳米材料在生活中越来越普及，其安全性问题也引起了广泛的关注。虽然现在纳米材料的毒性研究已经取得不少进展，但仍是更多地停留于器官、组织和细胞层面，对于更能揭示本质的分子水平的研究还存在严重的不足。在纳米材料与肺部疾病的研究中，多集中在体内外实验研究，人群流行病学的研究相对缺乏。另外，纳米材料特殊的理化特性，如表面积、形状、结晶度、表面电荷、溶解率、聚集状态等都会影响其毒性效应。同时，纳米材料健康和安全方面的风险的评估还没有统一的评估程序和评估方法，相关部门缺乏对纳米材料暴露的风险管理，也就是说纳米材料暴露人群的风险评估、暴露环境安全限值的制定以及纳米材料的安全生产和使用等方面均有待深入研究。
引用本文 Sun XY, Li YB, Guo CX. Research advances in pulmonary diseases induced by nanomaterials and their mechanism[J]. Tianjin Med J, 2016, 44(11): 1400-1405. [孙小怡，李艳博，郭彩霞. 纳米材料诱导肺部疾病及其机制研究进展[J]. 天津医药, 2016, 44(11): 1400-1405]. doi:10.11958/20160580.
参考文献【略】
