5只生物节律紊乱体细胞克隆猴。 中科院神经科学研究所供图
工作人员在给生物节律紊乱体细胞克隆猴喂食。
新华社记者 金立旺摄
中国科研团队宣布，通过体细胞克隆技术，成功获得5只BMAL1基因敲除的克隆猴。
这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型，意味着克隆基因编辑猴技术从理论层面迈向了实践层面。由此，中国开启批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代。
2018年1月，当两个体细胞克隆猴宝宝“中中”和“华华”第一次亮相时，科研人员就曾预言，中国将率先建立起可有效模拟人类疾病的克隆猴模型，既能满足脑疾病和脑高级认知功能研究的迫切需要，又可广泛应用于新药研发。
仅仅1年之后，这个预言便成为现实。1月23日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心研究团队对外宣布，通过体细胞克隆技术，成功获得了5只BMAL1基因敲除的克隆猴。这是国际上首次成功构建一批遗传背景一致的生物节律紊乱猕猴模型，意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面，中国正式开启了批量化、标准化创建疾病克隆猴模型的新时代。
该成果于北京时间1月24日在线发表于中国顶级英文期刊《国家科学评论》。
“失眠”猴 研究节律紊乱的理想动物模型
雄鸡报晓、蜘蛛半夜结网、向日葵在清晨开放……自然界中的生物大都拥有按时间节奏调节自身活动的本领，我们称之为生物节律，也就是通常所说的生物钟。
生物节律系统在维持机体内在的生理功能，以及适应环境的变化方面扮演着重要角色。生物节律紊乱与睡眠障碍、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、精神类疾病、糖尿病以及心血管等疾病密切相关。
中国科学院神经科学研究所所长、脑科学与智能技术卓越创新中心蒲慕明院士说：“非人灵长类动物在结构和功能活动等很多方面都与人类高度相似，是研究节律紊乱相关疾病机理和诊治手段比较理想的动物模型。”
2015年底，研究团队尝试利用CRISPR/Cas9技术，敲除了猴胚胎中的生物节律核心基因BMAL1，产生了一批生物节律核心基因BMAL1缺失的猕猴。
“在哺乳动物的大脑中，有一个控制生物节律的‘起搏器’，就是位于下丘脑的视交叉上核。如果将它损毁，动物的昼夜节律就会完全消失。”研究团队成员、神经科学研究所生物节律与衰老疾病研究组组长张洪钧研究员说，“这个‘起搏器’一般是通过一系列节律基因来调控昼夜节律的，BMAL1便是这些核心节律基因中的一个。”
等到半年后小猴们断奶，研究人员开始从多个方面进行观察。他们发现，敲除猴不再按照24小时的周期活动，夜间活动明显增多。此外，这些敲除猴的大多数节律基因表达异常，还有很多与睡眠剥夺、抑郁症以及衰老等相关的基因上调。
张洪钧说：“我们可以明显看出敲除猴表现出怕人的行为。比如，当保育员靠近时，它会双手抱住头部，蜷缩在角落里，不敢活动。”
基于此，研究团队最终确定，成功构建了世界首批核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型。
“克隆”猴 弥合不同个体间的基因差异
但是，核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型还不能作为理想的动物模型。
张洪钧说：“通过基因敲除方法获得的第一代模型猴个体间存在遗传背景和基因编辑嵌合率差异，也就是其中有个体的BMAL1并未被完全敲除，所以表现出生物节律紊乱症状的严重程度不一致。”
如何解决这个问题呢？
“个体差异大，对实验干扰就会比较大。”蒲慕明认为，利用基因编辑的细胞进行核移植是批量制备基因修饰猴模型的首选方法。
为此，研究团队采集了一只BMAL1基因敲除彻底、且睡眠紊乱症状最明显的猕猴体细胞，通过之前掌握的体细胞克隆技术，成功获得5只BMAL1基因敲除的克隆猴。
研究团队成员、神经科学研究所非人灵长类研究平台主任孙强研究员说：“经过检测，这5只小猴的细胞核基因型与核供体细胞完全一致，而线粒体基因型则与卵供体猴一模一样，同时它们的所有基因与生出它们的代孕妈妈则彻底无关，完全符合克隆动物的鉴定标准。”
值得一提的是，去年克隆“中中”和“华华”所使用的体细胞来自流产猴胚胎，而这次采用的是成年活体基因编辑猴的体细胞。
“克隆的成功率与作为核供体的细胞有很大的关系。”研究团队成员、神经科学研究所灵长类生殖工程研究组组长刘真研究员说，通常，细胞和人一样会在生长繁殖的过程中逐渐衰老，随着细胞不断分裂，会积累越来越多的DNA突变，细胞核的质量也会逐渐下降。所以，越年长的猴子，其体细胞活力就越弱，克隆难度就会增大，成功率也可能随之降低。
但令科研人员没想到的是，当他们在对这个经过编辑携带疾病基因的成年活体猕猴体细胞进行细胞核移植时，效率比想象的要高。
刘真说：“但这个现象是发生在特定细胞条件下，数量又少，是不是一个普遍规律还有待进一步研究。”
“保护”猴 新药研发有望减少实验动物用量
此次利用体细胞克隆技术制作脑疾病模型猴，意味着克隆基因编辑猴技术由此从理论层面迈向了实践层面。
孙强说：“‘中中’和‘华华’本质上都还属于未经过基因编辑的野生型猴子。而此次这5只BMAL1基因敲除的克隆猴是疾病模型猴，是真正意义上能够广泛被应用的新型高效的动物模型，将为人类重大脑疾病的机理研究、早期诊断与干预以及药物研发带来前所未有的光明前景。”
国际权威专家评价：“这项研究首次证实通过体细胞核移植技术可以克隆成年基因修饰猴。这为在短期内生产一批无嵌合体的基因修饰猴提供了一个完美的解决方案。这样的克隆猴模型对人类疾病研究有重要价值。”蒲慕明认为，该成果还有助于缩短药物研发周期，提高药物研发成功率，解决研发中“卡脖子”的问题。
对于公众所高度关注的克隆、基因编辑等技术所涉及的伦理问题，蒲慕明表示，这项工作的目的是为提高人类健康、研究脑科学基本问题服务，而且严格遵守了国际各项相关协议和规则，还可能使一些伦理争议得到化解。
猕猴是国际上常用的一种实验动物，目前，全世界每年对猕猴的使用量高达10万只，主要被用于药物筛选实验。蒲慕明说：“体细胞克隆猴技术让人们在1年内就能制备大批遗传背景相同的模型猴，大大减少了个体差异对实验的干扰。这样，只要使用很少数量的克隆猴，就能够完成很有效的筛选。”
蒲慕明表示，鉴于目前克隆技术是制造遗传背景一致的基因编辑猴成本最低、耗时最少的手段，而作为全球暂时唯一掌握非人灵长类动物克隆技术的中科院神经科学研究所，有望在未来的神经科学研究中抢先一步。
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