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编者语：1月26日我们推送了（点击可跳转）
【建模模拟】使用动态胃模型研究在禁食和非禁食情况下聚合物含量低的亲水基质骨架制剂的反应
给大家介绍了动态胃模型的应用，实际上他是这样一个装置。
我们在前面的微信推送中还特别给大家介绍了生物溶出介质的应用，同时很多同行购买了 《FDA生物等效性标准》这本书，通过阅读也了解到FDA对不同剂型不同治疗类别的药物生物等效性上的判定的标准和要求，通过这些内容的学习我们深刻的了解到对某些品种建立体外溶出和体内药代BE之间的关系的还是比较复杂的。需要针对不同的情况建立相应的标准。
今天继续给大家推送本群同行的翻译的文献资料，本文原文出自见下面截图所示。原文已经发到超级QQ群共享。通过本文内容学习你可以认识到，API粒径细微的差别，微粉化和纳米级非诺贝特制剂体外溶出试验预测到体内性质之间的可行性。通过这种真实的研究成果，可以让大家更多的了解目前欧美业内同行对此类品种和类似问题的看法和认识，有助于我们开拓视野和思路，并正确的使用溶出这个手段来解决问题。希望这个案例的展示能对各位有所帮助。
通过微粉化或纳米级非诺贝特的体外生物相关性溶出试验预测血浆分布曲线
Daniel Juenemanna，Ekarat Jantratid a，Christian Wagnera，Christos Reppasb，
Maria Vertzonib，Jennifer B. Dressmana
a 药物技术研究院，歌德大学，法兰克福，德国
b 药学院，雅典大学，雅典，希腊
摘要：本次研究评估了纳米级非诺贝特Lipidil 145 ONER和微粉化非诺贝特Lipidil-TerR通过体外生物相关性溶出试验预测体内性质的可行性。体外溶出使用了最新的生物相关性溶出介质模拟餐前和餐后的状态，选择USP装置2（桨法）。评价不同孔径的膜过滤器阻滞未溶解纳米药物颗粒的能力，结果显示，孔径为0.1μm和0.02μm的过滤器能够将溶解的药物分子与胶体和未溶解的颗粒分离。在两种不同的模型中，选择合适的过滤器尺寸，得到的体外实验结果通过STELLAR软件模拟血浆分布曲线：（a）假设吸收没有渗透限制模型（b）假设有渗透限制模型。将模拟的血浆分布曲线与纳米级和微粉化的制剂在空腹和进食状态下的体内数据进行比较。第一种模型，微粉化非诺贝特制剂的结果表现出良好的相关性，但对纳米级非诺贝特在空腹状态下的血浆分布存在过度预测。第二个模型与两种制剂的体内数据相关性都良好，并且与进食状态无关。比较两种模型的模拟结果，在空腹状态下，纳米级非诺贝特的吸收至少是部分渗透限制，而对于微粉化的制剂，非诺贝特的溶出是速率的决定因素。
关键词：生物相关性溶出试验，体内外相关性，非诺贝特，纳米级，过滤器尺寸，食物效应
1.介绍
许多新化学实体具有不宜口服吸收的物理化学特性，主要障碍是它们在水中的低溶解度和随之带来的溶解缓慢的问题，导致生物利用度不足。增加溶解速率的经典方法之一就是减小粒度，粒度和溶解速率之间的基础相关性可以通过以下Noyes–Whitney方程的变化来说明：
其中DR是溶解速率，ADrug是药物表面积，DDrug是药物的扩散系数，δ是扩散层厚度，CS是药物的饱和溶解度，Ct是在t时间溶解的药物的浓度。
通过微粉化来减小粒度，使得溶解速率增加，往往能同时获得更高更可靠的生物利用度。应用这种方法成功的例子在很多研究中都有详细记载[1-4]。最近，纳米技术也已经引进用以进一步的减小活性药物成分（API）的粒度，并以此提高其生物利用度。纳米级相对于微粉化的优势表现在显著的额外增加颗粒的表面积以及潜在的饱和溶解度的适度增加。
这些影响的科学背景在文献中有详细的描述[5-8]。此外，已经提高了粘膜吸附和/或直接摄取胶体粒子穿过肠膜的可能性[6,7,9,10]。
将API粒径降至纳米级范围的第二个优势是在某些情况下减少吸收对食物摄取的依赖性[11,12]。
非诺贝特是一种降脂药，不溶于水且表现出积极的食物效应。它的口服制剂已经随着时间改进，早期制剂是含200mg粗非诺贝特的胶囊(LipanthylR)。该制剂在血浆中表现出很高的个体差异性以及显著的食物效应，推荐与食物同服。2000年，“更高效”的片剂（Lipidil-TerR）上世，将非诺贝特微粉化后喷雾得到5-15um的颗粒[13]。微粉化使产品有了更高的溶解速率，这种含有160mg非诺贝特的“超高效”片剂与含有200mg粗非诺贝特的胶囊是生物等效的，并且变异性和食物效应都较小。最近，一种新型的湿法超细研磨技术已经可以将非诺贝特的中值粒径（D50）降低到500nm（TircorR,Lipidil 145 ONER）。这些制剂都具有优良的生物利用度，非诺贝特的剂量可以降低至145mg，仍然与200mg常规胶囊具有生物等效性。对于纳米制剂，因为没有观测到食物效应，可不依赖进食独立服用非诺贝特[14]。此外，微粉化的制剂在治疗高胆固醇血症和高甘油三酯血症中更有效，耐受性也更好。
本次工作的目的是研究非诺贝特在微粉化和纳米级制剂中的溶出。因此，实验设计区分了悬浮的药物颗粒和溶解的药物分子，这已经是一个多年的难题[15,16]。首先，确定各种孔径的过滤器。其次，研究生物相关性溶出介质(FaSSIF, FeSSIF, FaSSGF, FaSSIF-V2 and FeSSIF-V2 [17–19])中的溶解特性，以确定食物效应是否可以通过餐时状态函数的溶解特性来解释。在过去的十年中，生物相关性溶出介质已经成功应用于药物体内外相关性的研究[17,20–23]。最后，通过STELLAR9.1.1软件（isee系统，NH，美国）建立体内体外溶出相关性。
2.材料和方法
2.1试剂和材料
Lipidil 145 ONER（批号85900，SolvayArzneimittel，德国）和Lipidil-TerR（批号87247，SolvayArzneimittel，德国）是在德国药店中购买。卵磷脂(Lipoid E PCR, 纯度97.9%, 批号 108015-1-/042)来自Lipoid公司（路德维希港，德国）的友情赠送。甘油单油酸酯（GMO, Rylo MG19 PharmaR,99.5%单甘油酯，批号173403-2202/107）来自Danisco Specialities（布拉布兰，丹麦）。盐酸（31%-33%）来自Hedinger（斯图加特，德国）。磷酸（85%）和胃蛋白酶（欧洲药典，0.51 U/mg, 批号1241256）是从Fluka公司（布克斯，瑞士）购买。非诺贝特药物（批号016K1644）和马来酸（纯度99%，批号056K5473）是从Sigma–Aldrich公司（斯德海姆，德国）购买。油酸钠（纯度82.7%，批号51110）是从Riedel-de Haën公司（塞尔策，德国）获得。牛胆酸钠（NaTC，纯度＞97%，批号2007100274）是从ProdottiChimici e Alimentari SpA（巴萨卢佐，意大利）购买。其他试剂均为分析纯，来自MerckKGaA（达姆施塔特，德国）。长效牛奶（3.5%脂肪）来自Milfina，德国。
本研究中使用的注射器过滤器见下表1
表1 本次研究中使用的针头过滤器
过滤器 |
厂家 |
批号 |
材料 |
孔径（μm） |
Anotop 25 Plus |
Whatman，梅德斯通，英国 |
07006F |
氧化铝 |
0.02 |
Anotop 25 Plus |
Whatman，梅德斯通，英国 |
07005C |
氧化铝 |
0.1 |
Minisart RC 25 |
Sartorius，哥廷根，德国 |
17764 |
再生纤维素 |
0.2 |
Rezist 30 |
Whatman，达瑟尔，德国 |
7029474 |
聚四氟乙烯 |
0.45 |
GD/X |
Whatman，弗洛勒姆公园，美国 |
V378 |
玻璃微纤维GF/D |
2.7 |
2.2 溶解度测定
非诺贝特在FaSSIF和FeSSIF中的表观溶解度来自文献[24]。在FaSSGF, FaSSIF-V2 和FeSSIF-V2中的溶解度采用摇瓶法测定。37℃（n=6）下在轨道振荡器上摇动培养基中过量的粗非诺贝特。24h后，样品通过0.45μm孔径过滤器过滤(RezistR 30, PTFE)，滤液通过HPLC分析。此外，药物在FeSSGF中的测量溶解度（24h）是经摇瓶法24h后，通过2.7μm过滤器过滤并用乙腈沉淀蛋白质，HPLC检测[25]。
2.3 溶出度研究
Lipidil 145 ONER和Lipidil-TerR的溶出度测定采用USP装置2 ErwekaDT6 (Erweka，霍伊森斯塔姆，德国)，500mL介质，转速75rpm，温度37℃。FaSSGF，FaSSIF和FaSSIF-V2用来模拟餐前状态，FeSSIF和 FeSSIF-V2用来模拟小肠中的进食状态。
在5，10，15，30和60分钟取5mL样品构建溶出曲线，样品立即通过不同孔径过滤器过滤并用甲醇适当稀释，用新鲜介质替换样品。FeSSGF介质不能进行溶出度实验，因为该介质中含有牛奶，不能通过20-500nm孔径范围内的过滤器。尽管FeSSIF和FeSSIF-V2这两种介质的胶体结构不同，但是在这两种介质中的溶解速率被认为是近似的，因为它们的溶解度没有明显的不同。为了证实该假设对于模拟的结果不重要，进行了关于溶解速率的灵敏度分析（见2.7和3.4.2）Lipidil-TerR的初始溶解速率由完全溶解曲线计算。Lipidil 145 ONER在FaSSGF，FaSSIF和FeSSIF-V2中的初始溶解速率另行计算，在1，2，3，4，5分钟取出样品，过滤并立即用甲醇适当稀释。所有实验平行测三次。
2.4 非诺贝特的定量分析
通过HPLC法分析样品，HPLC系统包括了LaChromRL-7110泵，LaChromRL-7400紫外可见光检测器，LaChromR L-7200自动进样器（Merck Hitachi，达姆施塔特，德国）以及EZ-Chrom Elite工作站（BiochromLtd.，剑桥，英国），LiChroCARTR RP-18 5um，125×4mm硅胶柱，（Merck，达姆施塔特，德国）。流动相由80%乙腈和20% MilliQ水组成，用磷酸调节pH值至2.5，流速为0.85 ml/min洗脱非诺贝特约4.5min，设置UV检测器在254 nm处测定药物的浓度。
2.5 体外溶出数据分析
使用不同孔径过滤器得到的体外溶出曲线的差异可以用独立模型相似因子（f2）评价。f2值的范围从0到100，值高于50表明差异小于10%，因此，两溶出曲线具有相似性[26,27]。
2.6 体内药动学数据分析
口服，两室分析法，用WinNonlin 专业版4.1版软件分析药代动力学参数（Pharsight公司，芒廷维尤，加利福尼亚，美国）。用以获得药代动力学参数的血浆药物浓度-时间曲线来自文献[14]。口服给予的非诺贝特的这些曲线用于计算在空腹和进食状态下的微粉化和纳米级非诺贝特的药代动力学参数k10，k12，k21和V /F。无静脉数据可用于非诺贝特。这些参数在STELLAR 9.1.1中用于模拟来自体外溶出数据的血浆曲线。
2.7 非诺贝酸血浆分布的计算机模拟
使用STELLAR 9.1.1结合实验溶出结果得出非诺贝酸血浆分布，然后与文献中的血浆曲线进行比较。使用了两种不同的模型方法：
（A）基于Noyes-Whitney溶解理论的模型，由下式给出[28]：
（2）
其中D是药物的扩散系数，Г是形状因子，N是颗粒数，V是溶出介质的体积，δ是扩散层厚度，ρ是药物密度。项是z的常数，z值来自体外溶出实验，Wt是在时间t溶解的药物的量，W是待溶解的剩余药物的量，Xs是使溶出介质饱和的药物的质量，Cs是溶解介质中的饱和溶解度，而Ct是时间t时药物的浓度。此模型中的假设包括以下内容：（i）从胃的吸收忽略不计（ii）固体和液体从胃排空是同时的（iii）所有溶解的非诺贝特都被立即转运到粘膜，并已非诺贝酸的形式出现在血液中。该模型适用于亲脂性药物（曲格列酮，阿托伐醌，sanfretinem，GV150013X和塞来昔布）[25,28]。
（B）在第二个模型中，额外增加了一个部分，这个部分表示胃肠道粘膜，可以模拟渗透率限制
在这两种模型中，空腹状态下胃排空速率设定为2.8h-1，在进食状态下为4kcal / min[19,28]。此外，非诺贝特向非诺贝酸的转化都假定是完全的(e.g.[29])。还通过将相应参数改变为初始模拟中使用的参数的生理或测量值的五分之一到五倍来进行灵敏度研究。
2.8 模拟血浆分布的比较
使用AUC和C max的点估计，将模拟的血浆曲线与生物等效性的体内数据进行比较，当模拟血浆曲线的点估计90％置信区间在体内血浆曲线的0.8-1.25范围内时，建立生物等效性[30]。此外，还呈现Tmax的点估计。
3 结果与讨论
3.1 溶解度研究
非诺贝特在生物相关性介质中的溶解度（24h溶解度）如下表2所示。在FeSSIF和FeSSIF-V2中增加的溶解度可以解释为由胆汁盐，卵磷脂，GMO和油酸钠形成了增溶胶束[21,31]。在复杂乳状介质FeSSGF中的溶解度结果显示出非常高的标准偏差，这是使用多相系统的结果，给分析重现性带来了困难。
表2 37℃下24小时后测量非诺贝特在不同介质中的溶解度（平均值±SD，所有实验n = 4，除了FeSSGF n = 6）
介质 |
溶解度μg/ml(平均值±SD) |
FASSGF |
0.22±0.01 |
FASSIF |
13.7±0.5 |
FASSIF-V2 |
4.67±0.25 |
FESSGF |
147.49±93.67 |
FESSIF |
35.6±1.0 |
FESSIF-V2 |
78.84±1.0 |
3.2 使用不同孔径过滤器在FaSSIF和FeSSIF中的溶解
使用不同孔径过滤器得到的溶出曲线如图所示，图1表示Lipidil 145 ONER，图 2表示 Lipidil-TerR，两者的f2值如表3所示。
图1 使用不同孔径过滤器（0.02μm，0.1μm，0.2μm，0.45μm），纳米级非诺贝特（Lipidil 145 ONER）在FaSSIF（A）和FeSSIF（B）中的溶解曲线。虚线水平线表示非诺贝特在介质中的表观溶解度（24小时）。
图2 使用不同孔径过滤器（0.02μm，0.1μm，0.2μm，0.45μm），微粉化非诺贝特（Lipidil-TerR）在FaSSIF（A）和FeSSIF（B）中的溶解曲线。虚线水平线表示非诺贝特在介质中的表观溶解度（24小时）。
表3 溶出曲线的f2值比较（以0.1μm孔径作参考）
过滤器孔径（μm） |
Lipidil 145 ONER |
Lipidil-TerR |
|||
FASSIF |
FESSIF |
FASSIF |
FESSIF |
||
0.02 |
91.53 |
94.86 |
86.09 |
97.09 |
|
0.2 |
46.84 |
48.54 |
74.71 |
84.53 |
|
0.45 |
61.81 |
55.86 |
66.58 |
99.54 |
|
使用0.1μm或更小的孔径，来自纳米尺寸制剂的溶液中得到的药物最大浓度与非诺贝特在FaSSIF和FeSSIF中测量的溶解度（24小时）相同。通过孔径为0.2μm或0.45μm过滤得到的浓度超过测量的溶解度。这个结果，与较高的标准偏差结合，表明这种明显的“过饱和”是由胶体非诺贝特引起的，因为太细小所以不能被过滤器阻挡。比较从0.1μm和0.2μm孔径过滤得到的曲线，f2值小于50，这说明过滤器孔径的选择对于溶出曲线的意义是至关重要的。为了分离Lipidil145 ONER中的纳米药物和分子状态的非诺贝特，应当选择0.1μm或更小的过滤器孔径，使用较小的孔径（0.02μm）得到的溶出曲线具有可比性。
使用含有很少或不含胶体非诺贝特的微粉化非诺贝特进行类似实验得到相似的溶出曲线，与过滤器孔径无关，f2值总是高于65，表明在所有介质中的溶出曲线之间的差异小于5％。
3.3 最新的生物相关性介质中溶出曲线
在最新的生物相关培养基中重复实验，使用STELLAR 9.1.1模拟血浆曲线，Lipidil 145 ONER的溶出曲线见图3。如在第一系列的溶解试验中，仅孔径为0.1μm或更小尺寸的过滤器能阻挡纳米级的API，而一些胶体非诺贝特似乎能通过孔径为0.2μm的过滤器。因此，推荐使用0.1μm的过滤器孔径用于纳米级API的溶出测试。
图3使用不同孔径过滤器（0.1μm,0.2μm），纳米级非诺贝特（Lipidil 145 ONER）在FASSIF-V2（A）和FESSIF-V2（B）中的溶解曲线。虚线水平线表示非诺贝特在介质中的表观溶解度（24小时）。
BCS II类药物的口服吸收主要受制剂的溶出速率的限制[16,29]。然而，胶质非诺贝特的性质尚不清楚。有假设提出纳米范围内的胶体颗粒可能粘附到肠膜上或直接被吸收[5,6,10,32,33]。通过用STELLAR 9.1.1软件构建的不同模型产生模拟血浆分布曲线，来帮助证明这些理论。
3.4 非诺贝酸的模拟血浆曲线
3.4.1 空腹状态
3.4.1.1 模型A
最新的生物相关性介质更接近生理组成，因此更适合于模拟的目的[17]。因此，在这些介质中的溶出试验结果用于模拟STELLA中的血浆曲线R。使用最合适的分析方法（过滤器孔径0.1μm）。模型A基于假定溶解在胃肠道中的非诺贝特被即时吸收（即非诺贝特渗透性不限），随后非诺贝特转化为非诺贝酸而产生非诺贝酸的血浆曲线。来自模拟和体内血浆曲线的Cmax，Tmax和AUC的比率如下表4所示。模型A与微粉化Lipidil-TerR的血浆曲线相关性良好(图4A)，表明对于该制剂，药物的溶出是其在血液中溶解速率的单一决定步骤。
图4Lipidil 145 ONER和Lipidil-TerR在禁食状态下的模拟血浆曲线，（A）图为模型A，（B）图为模型B。（图中的示例颜色，请读者参考本文的网页版本）。
表4 在模型A中计算机模拟体内血浆曲线的Cmax，Tmax和AUC的比率。
Lipidil 145 ONER |
Lipidil-TerR |
||||
空腹状态 |
进食状态 |
空腹状态 |
进食状态 |
||
Cmax |
1.41 |
1.16 |
0.91 |
1.32 |
|
Tmax |
0.52 |
0.78 |
1.20 |
0.94 |
|
AUC |
0.93 |
0.97 |
0.98 |
0.99 |
|
模型A对非诺贝特纳米晶体的结果不支持纳米颗粒直接通过粘膜摄取的假设。模型A导致Cmax的高估，即使假设只有溶解的药物才有助于吸收。纳米制剂的模拟曲线和体内曲线之间有差异，可能原因是非诺贝特从该制剂中溶出比其吸收到粘膜中更快，即使非诺贝特经常被认为是BCS II类药物。Buch等提出了该假设，对于一般的亲脂性药物[16],纳米API的结果经常能推断出溶解可能不仅是吸收的唯一问题。因此，要在模型B中建立渗透率限制。
3.4.1.2模型B
吸收步骤（即渗透性限制）的实施能够更好的模拟纳米级制剂的体内曲线，同时保留溶解控制的微粉化形式的模拟(图4B)。进行敏感性分析，将肠溶解速率从制剂在生物相关性介质中的溶解速率的五分之一改为五倍，结果支持了对于纳米级非诺贝特吸收存在一些渗透性限制的假设，在较低溶解速率下不会有更合适的模拟了(图5)。近来已报道另一种难溶性API，阿瑞吡坦也具有类似性质[34]。点估计比率见表5
图5模型参数的敏感性：Lipidil 145 ONER（左）和Lipidil-TerR（右）在禁食状态下肠溶解速率（IDR）的影响。IDR从实验值的五分之一变到五倍。
表5在模型B中计算机模拟体内血浆曲线的Cmax，Tmax和AUC的比率。
Lipidil 145 ONER |
Lipidil-TerR |
||||
空腹状态 |
进食状态 |
空腹状态 |
进食状态 |
||
Cmax |
1. 14 |
1.06 |
0.90 |
1.20 |
|
Tmax |
0.86 |
0.97 |
1.37 |
1.04 |
|
AUC |
0.93 |
0.97 |
0.98 |
0.99 |
|
3.4.2 进食状态
进食状态下，模拟血浆分布与模型A和B的体内分布相关性良好(图6A和B)。对模型选择敏感性的缺乏可以通过进食状态下的零级胃排空速率（GE）率来解释。GE速率似乎是进食状态下非诺贝特吸收的重要限制因素：固体药物颗粒随时间逐渐进入小肠，随后快速溶解和吸收，因此非诺贝特从胃转移到肠的速率是受到限制的。由于空腹状态下的GE速率更快，当在空腹时服用剂型时，GE在整个吸收过程中起不到限制作用。
图6Lipidil 145 ONER和Lipidil-TerR在进食状态下的模拟血浆曲线，（A）图为模型A，（B）图为模型B。（图中的示例颜色，请读者参考本文的网页版本）。
空腹和进食状态下胃排空速率的灵敏度分析（图7A）支持这一假设。
图7（A）模型参数的敏感性：Lipidil 145 ONER在禁食状态（左）和进食状态下（右）胃排空速率（GER）的影响。禁食状态，GER从人群平均值的五分之一变到五倍；进食状态， GER从1 kcal / min变化到5kcal / min（人群平均值4 kcal / min）。（B）在进食状态下，Lipidil 145 ONER在胃（左）和肠（右）中溶解速率的影响。溶解实验中得到的结果从实验值的五分之一到五倍变化。
然而，模拟略高估了进食状态下的Cmax，可能的原因是：（i）进食状态下的吸收分数不是100%（ii）非诺贝特至非诺贝酸的代谢受到食物组分的阻碍，使得非诺贝特更慢地代谢为非诺贝酸（iii）使用线性胃排空速率用于模拟目的不能完全反映体内情况[11,35,36]。
4.总结
只有通过孔径小于0.1μm的过滤器才能得到纳米级非诺贝特的精确溶出曲线。使用较大的过滤器孔径会导致溶出曲线的过度预测，对于纳米制剂应当避免使用。
在溶解测试中使用生物相关介质与STELLAR软件相结合，得到进食和空腹状态下微粉化和纳米级非诺贝特的体外-体内相关性。在空腹状态下，当从微粉化变为纳米级制剂时，吸收的决定速率步骤从完全溶解控制变化为部分渗透控制。进食状态下，胃排空速率成为微粉化和纳米级非诺贝特吸收的决定速率。
致谢
这项工作致力于纪念Ekarat Jantratid博士(1975–2010)
感谢Murat Kilic先生在实验室的亲切协助
这项工作的一部分是在2008年4月西班牙巴塞罗那举行的APV世界会议上提出。
参考文献：略
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