我的CAR-T技术思考 (续一)——EFGR抗原分析与CAR-EGFR设计
马念 @17-Oct-2015
在上一篇微文（1032）中，笔者和大家探讨了个人对CAR技术研发的一些拙见，微文发出之后，笔者收到很多朋友的微信留言，有的朋友提出了更多的技术建议、有的纠正了我观点的不当之处、更多的朋友则咨询我们CART开发的进展情况，这里，我先对大家的关注表示衷心的感谢！这些都是笔者个人观点，学识有限难，免不当之处，所以也请大家见谅并及时给我微信留言指出不当之处（要是微信文章后面也有留言讨论功能就简便了，不知是否有？）。正式开篇前，先做点小澄清，第一，在上次微文的最后部分笔者已经说明了，BASR并不从事CAR技术开发，我们更看好的是精准细胞免疫治疗技术研发。（奥巴)-马总统都提出了精准医疗计划，作为本家的我，绝对得坚定的予以支持啊 :) ，这关系一下子拉到白宫了。第二，上文最后部分笔者提及的我个人看好的三个CAR技术方向，这些限于而且仅仅限于有丰富CAR技术经验的公司和机构，虽然我们鼓励跨域式的发展，但“大跃进”却也会适得其反，所以笔者不希望短期内有机构和团队以这几点作为宣传点。
最近肿瘤细胞免疫治疗领域十分受关注的事件之一有301/CBM公布他们anti-EGFR-CAR-T治疗实体瘤的I/II期临床结果。公布的结果还是相当的不错 (17例非小细胞肺癌有2例部分应答；5例胆管癌有2例完全应答、1例部分应答；1例胰腺癌部分应答；1例肾细胞癌疾病稳定。3级毒性只有1例)。 因此，这次笔者就借着EGFR的这股热浪，接着上一篇文章提及的13点方案（有朋友留言建议将这个“13步”可以再丰富些，其实笔者也就是凑个13的数，这个流程可以再丰富到15或20等均可以，但这个优化的就留给各位有兴趣的朋友，这样可以形成合适自身的独特的研发策略和流程）来进一步探讨下以EGFR为治疗靶点进行CART的研发。所以，笔者就先对抗原（EGFR）的基础信息的进行一些简单分析。
EGFR是什么？ 这个大家自己去翻书，去百度、谷歌都可以了。
EGFR在正常组织和肿瘤组织的表达情况。我相信从事以EGFR为治疗靶点的公司和技术人员都已经做过深入的分析了。这些大伽们可以直接跳过此段了。。。先看看EGFR在正常组织中的表达情况。
EGFR分子在正常组织中表达的切片图
EGFR蛋白在正常组织中的表达情况
所以EGFR在大部分组织都有中、高度水平的表达，比如胆囊、口腔粘膜、皮肤、支气管、及很多消化道组织，显然EGFR并不是肿瘤特异抗原，这样，针对EGFR的效应细胞，比如CART细胞，进入体内后在发挥作用（比如杀伤）时，这些阳性表达的组织和细胞也同样可能成为攻击的目标，这即是“on-target, off-tumor ”作用。但相对比较理想的是EGFR分子在肺组织、心血管系统和中枢神经系统的正常表达水平均非常低，而对这些组织或系统的攻击往往会有致命的毒副反应。那在肿瘤组织中的情况如何呢？
EGFR分子在部分肿瘤组织中表达的切片图
EGFR在肿瘤组织和对应的正常组织中表达情况比较
可见不同肿瘤组织中EGFR的表达水平差异还挺大。笔者对这些表达数据做了简单的数字化处理，见下图
CANCER |
NORNAL |
|||||
High |
Medium |
Low |
Neg |
|||
Breast C |
0 |
8.333 |
17 |
75 |
low |
|
Cervical C |
8.33 |
33.33 |
25 |
33 |
SEC:medium |
GC:0 |
Colorectal C |
0 |
75 |
25 |
0 |
medium |
|
Glioma |
50 |
25 |
17 |
8.3 |
0 |
|
Liver C |
0 |
25 |
17 |
58 |
medium |
|
Lung C |
9.09 |
54.55 |
0 |
36 |
Bronchus:high |
Lung:0 |
Lymphoma |
0 |
8.333 |
17 |
83 |
0 |
|
Melanoma |
0 |
36.36 |
9.1 |
55 |
0 |
|
Ovarian |
0 |
16.67 |
8.3 |
75 |
||
Pancreatic C |
12.5 |
25 |
38 |
25 |
0 |
|
Prostate C |
0 |
9.091 |
9.1 |
82 |
medium |
|
Rental C |
0 |
90 |
10 |
0 |
low |
|
Skin C |
9.09 |
54.55 |
0 |
36 |
medium |
|
Stomach C |
0 |
33.33 |
17 |
50 |
medium |
|
根据这些EGFR表达水平的数据，笔者认为，仅仅从抗原表达差异这个单一因素的角度分析，神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌为最合适于采用EGFR－CAR-T治疗的肿瘤类型（红色部分，这些肿瘤高、中度的表达EGFR分子的比例很高，而在相应的正常对照组织中则无表达或极低表达），一方面，从技术上这会大大有利于后期的CAR开发，另一方面，从疗效上，会更大程度的保证CART的最大疗效和最小毒性；而前列腺癌、胃癌、肝癌等则相反，不太适合EGFR的靶点治疗（蓝色部分，这些肿瘤组织无表达或只有小量中低度表达EGFR蛋白，而在对应的正常组织中EGFR却有中等水平的表达），因此容易导致毒副反应强而疗效弱；而其他则可能介于二者之间，针对这部分肿瘤的CART治疗，如要同时保证好的疗效和低的毒副反应，则需要经过更加严格的筛选，选择最合适的CAR，这当然会给研发带来难度。
回到开辟提及的３０１医院的临床试验数据，韩主任他们选择的试验肿瘤患者是17例非小细胞肺癌、5例胆管癌、1例胰腺癌和1例肾细胞癌。这其中，非小细胞肺癌、胰腺癌、肾细胞癌均为适合或比较适合的肿瘤种类，基本符合上面笔者的分析。（注：这里考虑的仅是肿瘤抗原表达差异这个因素）
接下来我们再看看作为靶点的EGFR分子中的抗原表位情况。同样，笔者先啰嗦一下有关抗原表位(Epitope）的一些概念。1）抗原表位一般是指蛋白质（抗原）分子中的一组氨基酸，它们是相应的单克隆抗体分子和抗原分子实际相结合的部位，所以这些蛋白质的抗原表位实际上决定着蛋白质抗原分子的抗原性。而一个长链的蛋白质分子一般都有多个表位，他们分布在蛋白质抗原的表面和内部的不同地方，这些表位可以刺激机体产生对应的抗体。2)抗原表位通常可以分为线性（连续性）表位(Linear or Continuous Epitope) 和构象（非连续性）表位(conformational or discontinuous Epitope)两大类，前者主要是由蛋白质上的一组连续的AA构成，而后者则由蛋白质中序列上不连续一起但空间上一起的AA构成。3）T淋巴细胞和B 淋巴细胞识别抗原表位的方式是不一样的，B淋巴细胞表面的BCR和其产生的抗体既可以识别线性表位也可以识别非线性表位，但B细胞只能识别位于抗原分子表面的抗原表位，大多数B细胞或抗体和抗原间的相互作用涉及构想表位，同样，CAR中scFv片段与抗原表位间的作用亦然。4）抗原表位分析对于CAR的研发并非是必须的，在上一篇文章发出后，就有微友提出意见，认为不一定非得分析抗原信息等，其实笔者也并不认为这是必须的，而且笔者也深信不少已经研发出高效的CAR的机构并不一定做过了表位等分析。但笔者还是建议在技术条件、资金条件等许可的情况做些这些基础的分析， 现今抗原表位分析技术，尤其是Epitope Mapping已经是疫苗、抗体药、蛋白质药等产品研发的核心环节，这不仅有利于开发更高效的产品、有利于产品的专利保护，而且美国FDA和欧盟EMEA也都要求企业提供这方面的分析数据了。5）抗原表位分析技术，尤其是Epitope Mapping是一个专业性、技术性很强的技术，技术上，也有包括X射线结晶学技术、多肽库或芯片技术、液相色谱质谱技术、生物信息学技术等多种分析方法。
蛋白质抗原和抗原表位
线性表位和非线性表位
OK，下面笔者就采用生物信息学技术的方法对EGFR抗原的表位进行一些简单的分析。第一步下载EGFR分子的AA序列(注：本文中笔者未考虑肿瘤内存在体细胞突变的情况），共１２１０个氨基酸，如下：
"MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA"
通过分析得到约１４个线性表位和４０个空间表位的信息，这里笔者随机选择其中一个表位的３D图像供参考。
表位２（LPVAFRGDSFTHTPPL）
这里整个分析过程笔者选用的大多是默认参数进行的分析，而在实际的研发过程中，研发人员必须根据自身项目的具体要求调整分析的相关参数。
Prediction for Structure for 3QWQ (PDBID，Crystal Structure Of The Extracellular Domain Of The EpidermalGrowth Factor Receptor In Complex With An Adnectin）
有了这一系列EGFR分子抗原表位的信息，研发人员可以根据各自研究计划，选择合适的表位的相应肽段进行一下步实验。可以用上述预先筛选的肽段免疫新建杂交瘤再测序和克隆、可以结合噬菌体展示技术直接用肽段来筛适合片段、当然也可以先直接测序和克隆现有的抗EGFR杂交瘤细胞再用表位分析技术来优化。总之，选择适合自身的方法。这笔者就不再多探讨了。最后再次说明一下，表位分析并非是CAR开发所必须的，至少现在法规上还没有明确要求，且不进行这个分析过程也完全可以开发出优质的CAR，不然又有微友、大伽们拿搬砖来拍我了，已经很多大包了。。。
参考文献
FDA:February 27, 1997: Docket No. 94D-0259 (document UCM153182)
EMA:effective since July 1, 2009: EMEA/CHMP/BWP/157653/2007
Structuresof adnectin/protein complexes reveal an expanded binding footprint. Structure. 2012
下期预告
下期马念准备接着和大家探讨以EGFR为靶点的CAR研发或基于免疫组学的免疫检测技术和应用
有关免疫治疗的相关内容，欢迎大家随时给我微信留言进行讨论。（个人微信号：james10von)。
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