药最网
首页

【1033】【马念读图】 我的CAR-T技术思考 (续一)——EFGR抗原分析与CAR-EGFR设计


我的CAR-T技术思考 (续一)——EFGR抗原分析与CAR-EGFR设计

马念 @17-Oct-2015

在上一篇微文(1032)中,笔者和大家探讨了个人对CAR技术研发的一些拙见,微文发出之后,笔者收到很多朋友的微信留言,有的朋友提出了更多的技术建议、有的纠正了我观点的不当之处、更多的朋友则咨询我们CART开发的进展情况,这里,我先对大家的关注表示衷心的感谢!这些都是笔者个人观点,学识有限难,免不当之处,所以也请大家见谅并及时给我微信留言指出不当之处(要是微信文章后面也有留言讨论功能就简便了,不知是否有?)。正式开篇前,先做点小澄清,第一,在上次微文的最后部分笔者已经说明了,BASR并不从事CAR技术开发,我们更看好的是精准细胞免疫治疗技术研发。(奥巴)-马总统都提出了精准医疗计划,作为本家的我,绝对得坚定的予以支持啊 :) ,这关系一下子拉到白宫了。第二,上文最后部分笔者提及的我个人看好的三个CAR技术方向,这些限于而且仅仅限于有丰富CAR技术经验的公司和机构,虽然我们鼓励跨域式的发展,但“大跃进”却也会适得其反,所以笔者不希望短期内有机构和团队以这几点作为宣传点。

最近肿瘤细胞免疫治疗领域十分受关注的事件之一有301/CBM公布他们anti-EGFR-CAR-T治疗实体瘤的I/II期临床结果。公布的结果还是相当的不错 (17例非小细胞肺癌有2例部分应答;5例胆管癌有2例完全应答、1例部分应答;1例胰腺癌部分应答;1例肾细胞癌疾病稳定。3级毒性只有1例)。 因此,这次笔者就借着EGFR的这股热浪,接着上一篇文章提及的13点方案(有朋友留言建议将这个“13步”可以再丰富些,其实笔者也就是凑个13的数,这个流程可以再丰富到15或20等均可以,但这个优化的就留给各位有兴趣的朋友,这样可以形成合适自身的独特的研发策略和流程)来进一步探讨下以EGFR为治疗靶点进行CART的研发。所以,笔者就先对抗原(EGFR)的基础信息的进行一些简单分析。

  • EGFR是什么? 这个大家自己去翻书,去百度、谷歌都可以了。

  • EGFR在正常组织和肿瘤组织的表达情况。我相信从事以EGFR为治疗靶点的公司和技术人员都已经做过深入的分析了。这些大伽们可以直接跳过此段了。。。先看看EGFR在正常组织中的表达情况。



EGFR
分子在正常组织中表达的切片图



EGFR蛋白在正常组织中的表达情况


所以EGFR在大部分组织都有中、高度水平的表达,比如胆囊、口腔粘膜、皮肤、支气管、及很多消化道组织,显然EGFR并不是肿瘤特异抗原,这样,针对EGFR的效应细胞,比如CART细胞,进入体内后在发挥作用(比如杀伤)时,这些阳性表达的组织和细胞也同样可能成为攻击的目标,这即是“on-target, off-tumor ”作用。但相对比较理想的是EGFR分子在肺组织、心血管系统和中枢神经系统的正常表达水平均非常低,而对这些组织或系统的攻击往往会有致命的毒副反应那在肿瘤组织中的情况如何呢?


EGFR分子
在部分肿瘤组织中表达的切片图



EGFR在肿瘤组织和对应的正常组织中表达情况比较


可见不同肿瘤组织中EGFR的表达水平差异还挺大。笔者对这些表达数据做了简单的数字化处理,见下图



CANCER

NORNAL 

High

Medium

Low

Neg

Breast C

0

8.333

17

75

low

Cervical C

8.33

33.33

25

33

SEC:medium

GC:0

Colorectal C

0

75

25

0

medium

Glioma

50

25

17

8.3

0

Liver C

0

25

17

58

medium

Lung C

9.09

54.55

0

36

Bronchus:high

Lung:0

Lymphoma

0

8.333

17

83

0

Melanoma

0

36.36

9.1

55

0

Ovarian

0

16.67

8.3

75



Pancreatic C

12.5

25

38

25

0

Prostate C

0

9.091

9.1

82

medium

Rental C

0

90

10

0

low

Skin C

9.09

54.55

 0

36

medium

Stomach C

0

33.33

17

50

medium

根据这些EGFR表达水平的数据,笔者认为,仅仅从抗原表达差异这个单一因素的角度分析,神经胶质瘤、胰腺癌、肺癌为最合适于采用EGFR-CAR-T治疗的肿瘤类型(红色部分,这些肿瘤高、中度的表达EGFR分子的比例很高,而在相应的正常对照组织中则无表达或极低表达),一方面,从技术上这会大大有利于后期的CAR开发,另一方面,从疗效上,会更大程度的保证CART的最大疗效和最小毒性;而前列腺癌、胃癌、肝癌等则相反,不太适合EGFR的靶点治疗(蓝色部分,这些肿瘤组织无表达或只有小量中低度表达EGFR蛋白,而在对应的正常组织中EGFR却有中等水平的表达),因此容易导致毒副反应强而疗效弱;而其他则可能介于二者之间,针对这部分肿瘤的CART治疗,如要同时保证好的疗效和低的毒副反应,则需要经过更加严格的筛选,选择最合适的CAR,这当然会给研发带来难度。


回到开辟提及的301医院的临床试验数据,韩主任他们选择的试验肿瘤患者是17例非小细胞肺癌、5例胆管癌、1例胰腺癌和1例肾细胞癌。这其中,非小细胞肺癌、胰腺癌、肾细胞癌均为适合或比较适合的肿瘤种类,基本符合上面笔者的分析。(注:这里考虑的仅是肿瘤抗原表达差异这个因素)

  • 接下来我们再看看作为靶点的EGFR分子中的抗原表位情况。同样,笔者先啰嗦一下有关抗原表位(Epitope)的一些概念。1)抗原表位一般是指蛋白质(抗原)分子中的一组氨基酸,它们是相应的单克隆抗体分子和抗原分子实际相结合的部位,所以这些蛋白质的抗原表位实际上决定着蛋白质抗原分子的抗原性。而一个长链的蛋白质分子一般都有多个表位,他们分布在蛋白质抗原的表面和内部的不同地方,这些表位可以刺激机体产生对应的抗体。2)抗原表位通常可以分为线性(连续性)表位(Linear or Continuous Epitope) 和构象(非连续性)表位(conformational or discontinuous Epitope)两大类,前者主要是由蛋白质上的一组连续的AA构成,而后者则由蛋白质中序列上不连续一起但空间上一起的AA构成。3)T淋巴细胞和B 淋巴细胞识别抗原表位的方式是不一样的,B淋巴细胞表面的BCR和其产生的抗体既可以识别线性表位也可以识别非线性表位,但B细胞只能识别位于抗原分子表面的抗原表位,大多数B细胞或抗体和抗原间的相互作用涉及构想表位,同样,CAR中scFv片段与抗原表位间的作用亦然。4)抗原表位分析对于CAR的研发并非是必须的,在上一篇文章发出后,就有微友提出意见,认为不一定非得分析抗原信息等,其实笔者也并不认为这是必须的,而且笔者也深信不少已经研发出高效的CAR的机构并不一定做过了表位等分析。但笔者还是建议在技术条件、资金条件等许可的情况做些这些基础的分析, 现今抗原表位分析技术,尤其是Epitope Mapping已经是疫苗、抗体药、蛋白质药等产品研发的核心环节,这不仅有利于开发更高效的产品、有利于产品的专利保护,而且美国FDA和欧盟EMEA也都要求企业提供这方面的分析数据了。5)抗原表位分析技术,尤其是Epitope Mapping是一个专业性、技术性很强的技术,技术上,也有包括X射线结晶学技术、多肽库或芯片技术、液相色谱质谱技术、生物信息学技术等多种分析方法。


蛋白质抗原和抗原表位


线性表位和非线性表位

  • OK,下面笔者就采用生物信息学技术的方法对EGFR抗原的表位进行一些简单的分析。第一步下载EGFR分子的AA序列(注:本文中笔者未考虑肿瘤内存在体细胞突变的情况),共1210个氨基酸,如下:

"MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA"

通过分析得到约14个线性表位和40个空间表位的信息,这里笔者随机选择其中一个表位的3D图像供参考。



表位2(LPVAFRGDSFTHTPPL


这里整个分析过程笔者选用的大多是默认参数进行的分析,而在实际的研发过程中,研发人员必须根据自身项目的具体要求调整分析的相关参数。



Prediction for Structure for 3QWQ (PDBID,Crystal Structure Of The Extracellular Domain Of The EpidermalGrowth Factor Receptor In Complex With An Adnectin)

有了这一系列EGFR分子抗原表位的信息,研发人员可以根据各自研究计划,选择合适的表位的相应肽段进行一下步实验。可以用上述预先筛选的肽段免疫新建杂交瘤再测序和克隆、可以结合噬菌体展示技术直接用肽段来筛适合片段、当然也可以先直接测序和克隆现有的抗EGFR杂交瘤细胞再用表位分析技术来优化。总之,选择适合自身的方法。这笔者就不再多探讨了。最后再次说明一下,表位分析并非是CAR开发所必须的,至少现在法规上还没有明确要求,且不进行这个分析过程也完全可以开发出优质的CAR,不然又有微友、大伽们拿搬砖来拍我了,已经很多大包了。。。

参考文献

  • FDA:February 27, 1997: Docket No. 94D-0259 (document UCM153182)

  • EMA:effective since July 1, 2009: EMEA/CHMP/BWP/157653/2007

  • Structuresof adnectin/protein complexes reveal an expanded binding footprint. Structure. 2012


下期预告

下期马念准备接着和大家探讨以EGFR为靶点的CAR研发或基于免疫组学的免疫检测技术和应用



有关免疫治疗的相关内容,欢迎大家随时给我微信留言进行讨论。(个人微信号:james10von)。


(本文为PEIT精准医疗资讯独家整理,未经允许不可盗用,转载请务必注明出处、链接和作者马念





PEIT精准医疗资讯平台

本文来源:PEIT精准医疗资讯

编辑:马念

Email1020850105@qq.com

微信号:james10von




图片识别二维码,关注PEIT精准医疗,收阅更多信息



长按图片识别二维码加入先机生物治疗沙龙



相关话题

相关话题

}