我的CAR-T技术思考
马念 @Sep-2015
随着CAR-T细胞在临床研究中取得绝大成就，CAR-T细胞治疗技术在国内就一下子红火起来，公司、医疗机构、投资机构纷纷踏入CAR-T治疗领域；院所的科研人员、医院的临床大夫、公司的技术人员纷纷开始从事CART技术研发。 据不完全统计现在国内声称从事CAR-T技术开发的单位和研究组有数百之多。 从大论坛、小会议、到微信群、QQ群，大家都在讨论CAR-T细胞技术、宣传CAR-T细胞技术、或推广CAR-T细胞技术，甚至在一些患者群里很多肿瘤患者也都在热聊CAR-T治疗。最近几天，有几个朋友问我CAR-T细胞治疗技术的关键要素以及研发方向等问题。我觉得这个问题并没有一个标准答案，仁者见仁智者见者，不同的目的、不同的高度有不同的解答。笔者就今天和大家一起探讨、分享下这个话题以及相关的CAR的设计问题。
首先show两张图片，展示一下国际上CAR-T免疫治疗的热度。
近年细胞免疫治疗领域投资大单
（很多交易的都是早期项目甚至还是Discovery阶段的项目，国内的投资还需要更多些的魄力啊）
上市的知名免疫治疗科技公司的股价和市值（2015年）
（尽管产品均在临床试验中而没有获批，但他们是不是已经显示出相当的有“钱”力了。纳斯达克可谓是科技风向标啊）
CAR-T细胞技术仍然存在的一些挑战
首先，笔者个人认为CAR-T细胞治疗技术现在还不能算是一个成熟的肿瘤治疗技术，最起码目前还没有获得FDA批准（大多还处于临床试验阶段），仍然有大量的问题研究和解决。所以研发的内容和方向就包含有太多的问题了，从的大的方面讲，有：
· 如何进一步提高治疗的有效性？
· 如何进一步降低治疗的毒副反应？
· 如何实现在实体瘤中的应用？
· 如何降低治疗的成本？
· 如何快速、大规模制备CAR-T？
· 如何实现CAR-T细胞的通用化？
· 其它。。。
其中，前三个问题的解决我认为对于公司可能尤为迫切和有意义。而在CAR－T的研发中如何利用CAR的设计来解决这些问题，下面笔者结合自己的工作经验，谈谈一些粗浅看法。
T淋巴细胞活化的双信号理论
在讨论这个问题前，我们先简单回顾一下人体T淋巴细胞正常情况是如何活化的。现在有关T淋巴细胞的抗原活化的成熟理论是“双信号理论”，即TCR/CD3复合体与pMHC复合体特异性结合产生的第一活化信号、及协同刺激分子（CD28等）和相应配体（CD80/CD86等）结合产生的第二活化信号，有些学者，在此基础上再加上细胞因子和配体结合产生的第三信号，形成“三信号学理论”。
T细胞活化的三信号理论
· 而现在大量的研究证明外周中成熟的T细胞的活化是由其接收到的信号的总强度决定的，而这个信号强度存在一个阈值范围。当产生的信号强度低于阈值下限时，尤其是在缺乏第二信号时，T细胞无法活化或变为无能（anergy）状态，而但信号强度过大，超过上限时，T细胞则发生凋亡。 这也是在体外培养T细胞时，为什么可以直接利用抗CD3单抗或联合CD3单抗、抗CD28单抗来激活T细胞的原理；同时，也是为什么单抗使用量务必要适度，过度激活，T细胞反而会大量死亡的原因。T细胞活化的第一信号和第二信号的机制CAR细胞技术的基本。
· T细胞识别APC（抗原提成细胞间）上的pMHC复合物的过程并不是上图中的平面的静态的过程，实际上是个四维度的动态过程 （Immune Synapse Formation）。比如，细胞表面不同的分子和配体的大小和空间结构均不一样且随着受体配体结合而变化的、各分子与配体相互结合的时间顺序并不一样、他们的表达量也是动态变化的、细胞表面的分子与配体相关结合后，在细胞表面的空间分布也是动态变化的，而这些均决定着T细胞的活化和活化后的功能。与CAR的设计也密切相关。
在T细胞的活化中，除了CD28外还有多种协同刺激信号分子。他们在T 细胞的活化中也发挥着重要重要。 此外，还有一群协同抑制信号分子，他们与相应的配体结合后则发挥着相反的作用，即抑制T细胞的过度活化，目前同样非常火热的PD-1抗体和PD-L1抗体是这类产品。而这些协同抑制分子的作用机制也逐渐被应用到CAR的设计中。
影响CAR-T细胞（体内）功能的一些重要因素：
OK, 现在返回主题， 笔者认为影响CAR-T细胞体内抗肿瘤效果的重要因素有：
· CAR 的特异性和敏感性；
· CAR分子在T细胞上的表达丰度；
· CAR和靶点结合后诱导的信号活性的强度和持续时间；
· CAR-T细胞在体内的数量和他们到达肿瘤部位的数量以及持续的时间；
· CAR-T细胞和体内靶细胞接触的时间；
· CAR-T的低毒副反应。
这些因素并非独立作用，而是相互影响的。其中，笔者认为最为首要的的一个因素就是特异性和敏感性，因为这可以影响到活化信号的强弱、与靶细胞作用的时间和毒副反应的高低等其它各种因素，所以这次就和大家扼要的探讨如果保证CAR的优良特异性和敏感性。
决定CAR-T细胞作用特异性和敏感性的因素
这里指的不仅仅是CAR结构中的单链抗体与靶抗原结合的特异性和敏感性，而指CAR-T细胞与靶细胞作用时功效上的的特异性和敏感性。
· 筛选肿瘤特异性抗原和对应的特异性抗体。大家都清楚目前应用于肿瘤免疫治疗的肿瘤靶抗原大多是肿瘤相关抗原（TAA），即这类抗原即表达于肿瘤组织，同时也表达于人体正常的组织，比如CAR技术中最常用的CD19抗原、CD20抗原、Her2抗原等。这导致CART细胞在攻击靶抗原阳性表达的肿瘤细胞的同时亦可能杀伤靶抗原阳性表达的正常的细胞，从而导致off-target 或者on-target，off-tumor类的严重毒副反应，临床研究表明这类毒副反应是可能有致命性的。 所以笔者一直认为筛选肿瘤特异性抗原（TSA，即表达于肿瘤组织细胞的特异性抗原靶点），再研发基于这些TSA的抗体或CART等细胞技术是解决这一问题的根本办法。尽管要到达这个理想目标一直都非常难，但可喜的是随着肿瘤基因组学和二代测序技术的发展，这个理想方法的实现变得很现成可行（这也正式我们研发的技术），当然，这一技术途径本身的技术要求很强，而且基于这个技术途径筛选出来的肿瘤特异性抗原（新抗原）具有高度个体化的特性，所以目前和CAR技术结合使用，仍然存在成本、时间周期等方面的挑战。
· 筛选具有精准亲和力的针对肿瘤相关抗原的单链抗体。尽管共表达于肿瘤组织和正常组织的TAA可能导致重要毒副反应，但很多TAA在肿瘤组织和正常组织的表达量均具有很大的差异。笔者在《基于嵌合抗原受体的肿瘤免疫治疗的研究进展》一文中，就指出利用这种表达差异研发具有特定亲和力的CAR将是非常可行的有效解决途径，这里的亲和力是指CAR中的单链抗体（scFv片段）与靶抗原结合的亲和力。也就是说，高亲和力的CAR可以识别结合所有表达靶抗原的癌细胞和正常组织细胞，而特定的精准亲和力的CAR可以识别结合绝大多数癌细胞上的靶抗原，而不于少量表达靶抗原的正常组织细胞结合，从而达到有效抗肿瘤效果的同时又低毒副反应的要求，这个技术思路在抗体药的开发中常被应用到，而在细胞免疫治疗中没有被重视。但最近CancerResearch杂志上关于CAR-ERGF和CAR-Her2的几篇研究（Affinity-TunedCAR-T Cells）都证实了我的这一观点的可行性，我相信这一下技术将很快被用于治疗实体瘤的CAR-T细胞技术的开发 （遗憾的是笔者当时没有做些相关实验，申请些专利啊。哈哈）。当然，这一技术途径也还有问题需要进一步研究：1)、肿瘤抗原表达的个体差异较大，筛出一个适合于大多数肿瘤患者的该类抗体也具有一些挑战性；2)、晚期肿瘤组织形成了强大的免疫逃逸能力，其中，肿瘤抗原表达量的下降就是主要机制之一，这给具体有特定亲和力的抗体带来挑战；3)、和原有的CAR结构中的scFv片段对靶抗原亲和力越大CAR-T细胞抗肿瘤功能越强的观点不同，新的研究表明，scFv的亲和力需要在一个合适的阈值范围内才能保证CART的理想功效，这又和T细胞活化的双信号理论相一致了，而这个适合的亲和力阈值范围与上述的特定特定亲和力是不是一致也是一个挑战。 但随着新的抗体高通量筛选方法，抗体筛选只是一个财力、人力和时间的问题了。另外，上文提及的最近的这两篇文章，笔者都没有详细研读，也有一点可能他们已经完美解决了这几点问题。
Affinity-tunedErbB2 CART cells 具有良好的治疗指数（小鼠体内研究）
· 筛选合适长度CAR胞外片段。前文提及T细胞通过识别靶细胞上的pMHC复合物而开启了活化之路。但与T细胞表面的TCR不一样，CAR结构中的抗体片段（单链抗体，scFv片段）是直接识别和结合靶细胞表面的抗原的外部表位（Epitope,指抗原分子上被抗体识别的一小段氨基酸片段，一个抗原分子可能会存在多个抗原表位）的，所以靶抗原上对应表位的空间位置，可以直接影响CAR-T细胞的活化和功能，这要求在设计CAR时必要考虑胞外spacer片段的长度，这个一点在很多研究中已经得到验证。所以关键是如何确定CAR片段中胞外的合适长度，而这一问题目前还没有一个明确的模型或答案，有效的方法就是大量筛选，又是一个拼财力、人力和时间的因素。
· 筛选合适的协同刺激分子信号片段。有前面的双信号理论，这一点就非常好理解了，而现在一代、二代、三代CAR的主要区别也在于此，其实CAR中协同刺激信号肽片段的区别，不仅仅会影响到CAR-T细胞的活化，而影响CAR-T细胞的作用特异性，还会进一步影响到T细胞的体内存活时间等其它很多功能特性，与体内实际抗肿瘤效果密切相关。
· 其它还有很多因素。比如，跨膜片段和结构的筛选（据笔者了解这点至目前还没有收到重要）、双信号CAR技术、抑制性CAR技术等均可影响CAR-T的作用功效。这些诸多其它因素这里就不逐一讨论了，有兴趣的可以私下交流。
“马念CAR设计13S方案“
尽管现在千军万马涌进CAR技术研发，但笔者深信还是有些负责人并没有完全理清CAR设计的主要要素和环节，哎呦 （有人给我拍砖啊） J 。公司更讲究投入与产出，所以这对于公司负责cart研究的技术人员就尤为重要。
S1、 确定治疗靶点的肿瘤抗原；
S2、 确定靶抗原在肿瘤组织和正常组织的表达情况；
S3、 确定抗原表面的抗原表位分布；
S4、 确定有无特定抗原表位的对应单克隆抗体和杂交瘤细胞株和知识产权问题；
S5、 确定单链抗体（scFv）库，购买和自行构建。尤其是在S4无法解决时；
S6、 确定spacer长度范围和序列、
S7、 协同刺激信号肽的种类、数量和在CAR结构中的位置；
S8、 确定转染体系，病毒载体系统或其它系统；
S9、 克隆或筛选不同亲和力的和最合适的scFvs，并进行体验证；
S10、 克隆和筛选理想的linker和spacer系列，并进行验证；
S11、 克隆和筛选理想的协同刺激信号肽序列，并进行验证；
S12、 建构和筛选CAR，包装CAR病毒颗粒，并进行动物试验；
S13、 优化CAR设计、重新设计CAR 或双CAR等；
· 首先这些步骤是一般性过程，而且是笔者自己总结的方案，所以大伽们请不要和我较劲您拥有的先进的独特技术流程啊；
· 13这个数字有些地方带有点二二的意思，就算是对我自己的评价吧 J；另外，很多欧美人都认为13是个很不吉列的数字，就像国人不喜欢4一样， 不过做技术开发还是别太信这，不过提示马念方案还有待改良啊；
· S1-S8属于前期调研和论证过程，当然也可能需要一些相关实验室预试验，对于公司新立CART项目，这些必须有充分的data的，不然可能事倍功半、对于投资人选一个新的CART项目，有了临床数据和临床前数据当然最好，但如果还只是规划或方案等，就这个方案也就是要详尽的ＤＡＴＡ了，不然打水漂也不可能，当然大多投资人都是最最聪明的一群人，有的办法和途径来评价项目；
· S4、S5、S7 属于同一范畴，毫无疑问，抗体库是最理想的方式，但是需要有投入和技术来支持的，所以目前相当多的仍然是用S4中的方法，但可能会存在知识产权问题（国内的部分单位或多多少的会涉及到侵权问题的）。但总目的都是获得理想的scFv的基因序列。但笔者认为最关键一步，如前文所述，这一步决定着后面其它步骤中的内容，所以建议一定要踏踏实实的做好，不然其它那些花俏的亮点和技术都可能是浮云；
· S6、S7一般可以利用公用资源，不涉及专利或知识产权问题，可以放手做，但建议也做些论证；
· S9、S10、S11、甚至S12这几点中，笔者强力建议都建成各自库，但我也是这样要求的。这样既可以保证能够构建出最理想的CAR，又可以便于公司CAR产品线的开发。而在拥有这些“库”的团队或公司无疑拥有绝大的优势；
· 理想的CAR的设计和验证需要长期的过程，很难立竿见影、一蹴而就，所以进入S13这步是非常常见 的，反而，没有经历过这一步的话，就要说明你真的是luck满满的。
· 总之，还是之前提及的那句话，CAR-T细胞技术好比象棋，构建几个CAR不难，拿出安全有效的CAR-T并非易事，但整体来讲，开发出一个理想的CAR-T只是个时间问题，只是技术、财力和人力比拼，而在国内不差钱的背景下，CART研发公司如雨后长春般增加的状况下，技术大伽就是公司的宝贵财富（哪怕是熟悉其中一个环节的大伽）
CAR未来技术
这个是个相关有高度和难度的问题，毕竟现在CAR，尤其是国内的CAR技术还算是刚刚起步。但要是马念来规划CAR开发的话，除了和大多公司一样，研发可以临床应用的系列CAR-T细胞技术外，我会在几个方面发力：
首先说明一下，因为CAR技术并不太符合我们的精准细胞免疫治疗技术方案，所以我们现在已经不从事CAR细胞技术开发，细胞技术这个环节，我们一个方向是从事CAR样TCR细胞技术的研发。(有点绕口, forget it！）
· CAR-T库技术。这个的重要意义前面已经提及了。
· 通用性CAR-T细胞技术。解决必须自体血问题和肿瘤特异性问题，这绝对是生物药企的最理想的一个目标，技术可能性就不多说了。
· CAR设计和开发平台。现在CAR- T 的开发，还都是依赖于运气、依赖于各种高通量筛选技术，而缺乏一个数学模型或实验模型和平台，而这或许才是CAR技术开发的根本或上游，通俗的讲，就是让CAR设计和开发的变得简易的工具。类似于微软的 office系统让现代化办公简单易行。是不是挺酷。有投资人感兴趣吗 ？ 哈哈
参考文献
· Thebasic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Can Discov 2013
· Affinity-TunedErbB2 or EGFR Chimeric Antigen Receptor T Cells Exhibit an IncreasedTherapeutic Index against Tumors in Mice. Cancer Res. 2015
· TuningSensitivity of CAR to EGFR Density Limits Recognition of Normal Tissue WhileMaintaining Potent Antitumor Activity. Cancer Res. 2015
· 基于嵌合抗原受体的肿瘤免疫治疗的研究进展. 转化医学杂志 2015
下期预告
下期马念准备和大家探讨基于免疫组学的免疫检测的技术和应用的议题或者进一步探讨CAR技术开发的议题，看大家期望的 :)
有关免疫治疗的相关内容，欢迎大家随时给我电邮或微信留言交流讨论。（个人微信号：james10von)。
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