HPLC系统色谱峰扩展与色谱柱柱效

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概述

分析物被注入HPLC系统之后，在色谱柱内随着流动相进行迁移并最终从色谱柱中洗脱出来，经检测器检测到的整个过程中，都存在引起色谱峰扩展的因素，包括进样器，色谱柱，检测器，连接管路以及接头等。色谱峰扩展过大导致色谱峰的宽度增加，一定浓度下的样品的峰高降低，导致分析方法的灵敏度降低，众多引起色谱峰扩展的因素可进行简单划分为色谱柱内色谱峰扩展与色谱柱外引起的色谱峰扩展，可以下图1中公式表示：

Fig.1 Contribution of band broading in HPLC system

 

色谱柱外因素引起的色谱峰扩展主要是由于各个仪器部位的死体积以及管路引起的，如各个Peek接头处的死体积，检测器流通池处体积的大小以及色谱柱后管路。色谱柱内引起的色谱峰扩展，也包括色谱柱的死体积以及各种扩散效应，传质阻力以及高压所引起的热效应。

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仪器死体积较大引起的色谱峰扩展

影响分析物在色谱柱内色谱峰扩展的因素比较多，包括色谱柱填料的颗粒大小，颗粒的均匀度，柱床填充的均匀度，色谱柱的长度，色谱柱的内径以及色谱柱的死体积等。

 

色谱柱填料颗粒越小，粒径分布越均匀集中，柱床填充也就越容易填充均一，色谱柱内死体积也就越小，相对地色谱柱的柱效也会越高。但是，同一根色谱柱用在不同的仪器上，所表现出来的实际柱效可能有所不同，这与所用仪器的状况有紧密的联系，如下图2所示。

Fig.2 Apparent efficient of different columns under different instrument

 

如上图2所示，200mm × 4.6mm，5um的色谱柱的柱效与100mm × 2.1mm，2.5um的色谱柱在理想的仪器状态下，基本具有相同的柱效(图中红色虚线与蓝色实线)，这也说明填料颗粒上的不足，可以通过增加色谱柱的长度来进行弥补。而同样一根100mm × 4.6mm，2.5um的色谱柱，在50uL²的死体积的仪器上使用时，其柱效要小于200mm × 4.6mm，5um填料的色谱柱，且其柱效随着测试所用的分析物的容量因子的增加而增加，说明色谱柱的理论柱效是不低的，由于仪器死体积较大，对于保留较弱的测试分析物而言，仪器引起的色谱峰扩展较大，造成实际测试柱效较低，这也是小填料细内经色谱柱不适宜用于HPLC仪器上的原因。

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色谱柱内径对色谱峰扩展的影响

同样填料粒径的条件下，色谱柱的内径大小对于色谱峰的扩展是否具有明显的影响呢。窄内径色谱柱在较低的流速下即可获得较高的流动相线速度，能够节省流动相降低成本，特别是对于HPLC-ESI-MS来说，窄内径的色谱柱的低流速，高线速度特点，可以明显提高方法的检测灵敏度，如下图3所示。

Fig.3 The influence of flow rate on relative response of ESI and APCI source

 

但是，较宽内径的色谱柱对于仪器的死体积要求不像窄内径色谱柱那样要求严格，在不同的仪器上使用都能够具有很好的重现性，窄内径小填料颗粒的色谱柱在HPLC上的使用，除了压力受限之外，最大的因素还是来自于HPLC系统的死体积较大，造成表观柱效较低。

 

下图4比较了相同填料粒径的条件下，不同的内径对于色谱柱柱效的影响。

Fig.4 The influence of inner diameter on column efficient

 

在上图4中，比较了不同内径的色谱柱的理论塔板高度，我们发现4.6mm内径的色谱柱的理论塔板高度要比2.1mm的内径的色谱柱低。首先，细内径的色谱柱在相同的填料粒径的条件下，压力要比宽内径的色谱柱要大，在色谱柱的轴向上由于压力引起的热效应要大于宽内径的色谱柱，因此，热效应引起的色谱峰扩展是其中的一个因素，但不是主要因素。

 

主要因素在于色谱柱内的扩散以及传质阻力效应，其中涡流扩散效应与传质阻力效应之间存在交互作用(如Van Deemter曲线的右半部上升段，纵向扩散为左半部下降段)。

Fig.5 Van Deemter equation of HEPT

 

上述方程，我们都很熟悉，A为涡流扩散项，B为纵向扩散项，C为传质阻力项。对于纵向扩散，可以通过增加流速以及减小溶质在流动性中的扩散系数的方法(如更换有机相的种类)来减小；传质阻力项，可以通过增加色谱柱的温度，使用小填料颗粒以及降低流速的方式来减小。

 

涡流扩散项与色谱柱内的填料填充均匀度有关，进而导致流动相流速的不一致。如填料颗粒之间的间隙通道内的流动相流动的不均一性(通道中间流速较大，靠近颗粒表面区域的流速较低)；不同颗粒间隙内的流速不均一性(与色谱柱内部不同区域内填料密度有关)以及色谱柱径向填料填充的不均一性(越靠近色谱柱的内管壁，色谱填料填充的越均一，密实)，造成色谱柱内径方向上的流速差异。如下图6所示

Fig.6 Kinds of eddy diffusion

 

在上述三种引起涡流效应的因素中，最后一种是主要因素，如下图7所示，在对前两种扩散效应进行模拟以及实际测试色谱柱内的总涡流扩散效应的时候，可以发现实际测定的总涡流扩散效应要远大于模拟的前两种涡流扩散效应的总和。

 

回到上图4中的问题，分析物注入色谱柱之后，随流动相在纵向进行分配迁移的同时，也会发生径向扩散(radius)。对于细内径的色谱柱，相通的线速度的前提下，分析物在色谱柱径向上的扩散首先进入到填充的密实区，即管壁效应区，涡流扩散效应要比粗内径的色谱柱要大，因此其理论塔板高度要高于粗内径的色谱柱的理论塔板高度。

 

因此，在使用小粒径填料，如1.8um的时候，一般采用窄内径的色谱柱且控制其长度，在发挥小粒径填料的低塔板高度特点的同时，有效规避色谱柱的内管壁效应，提高色谱柱的柱效，另外也可节省流动相，减小成本。

Fig.7 Simulation and determination of eddy diffusion effect

 

但是，对于毛细管柱而言，其内径越低，填料颗粒越小，其理论塔板高度却越低，柱效也就越高。

 

填料颗粒的均匀度也是造成涡流扩散的主要因素，填料颗粒分布范围越窄，上述三种形式的涡流扩散都会减小，反之，颗粒分布范围越宽，色谱柱内的涡流扩散现象越严重，如下图8所示。从图中也可以看到Titan 1.9um，D90/10为1.1的的色谱柱的理论塔板高度要比另外两种D90/10为1.4的色谱柱的理论塔板高度低的多。

Fig.8 The influence of particle size distribution on column efficient

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管路以及流通池引起的色谱峰扩展

管路的内径以及检测器的流通池的大小亦是引起色谱峰扩展的因素，如下图9所示。使用不同体积的流通池，得到的色谱柱实际塔板数也不同，随着流通池体积的减小，色谱柱的塔板数增加，色谱峰的柱外扩展降低。

Fig.9 The influence of flow cell volume on column efficient

 

下表1与图10是不同内径的柱后管路(用以连接色谱柱与检测器流通池)对于色谱柱实际塔板数以及色谱峰柱外扩展的影响。窄内径的管路具有更大的线速度，因此在管路的轴向上的扩展相对较小，能够获得更多的实际塔板总数，提高色谱柱的实际柱效。

 

Table 1 The influence of inner diameter of tubing on column efficient

Fig.10 The influence of inner diameter of tubing on column efficient

最后，过大的进样体积，过高的进样浓度以及溶剂效应也会增加分析物在色谱柱内的扩展。进样体积过大的话，样品刚注入到色谱柱的柱头上时，就已经产生了较大的扩展，而样品的浓度过大的话，可能会超过色谱柱的载样量，涡流扩散项与传质阻力项变大，分析物在色谱柱内的扩展增加。溶剂效应对于分析物在色谱柱内的扩展的影响比较大，当溶剂效应发生的时候，涡流扩散项，轴向扩散项以及传质阻力项都会增加，造成理论塔板高度急剧增加，色谱柱柱效下降严重。

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结论

分析物在HPLC系统内的扩展包括色谱柱内扩展以及色谱柱外扩展，色谱柱内的扩展包括轴向扩展，涡流扩展以及传质阻力引起的色谱峰扩展。色谱柱外引起色谱峰扩展的因素比较多，包括进样器系统，管路系统，检测器流通池以及进样体积、进样浓度以及溶剂效应等。色谱柱的色谱峰扩展主要与色谱柱内的物理特征有关，如填料粒径，色谱柱的内径，填料颗粒的均匀度等，而色谱柱外的扩展主要是由于仪器系统的死体积导致。

 

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