付长华 郞明洋
花园药业股份有限公司
浙江 金华 322121
摘 要：目的：建立HPLC法，用以同时测定心脑健片中表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因的含量。方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱（5 μm，200 mm×4.6 mm），以乙腈-0.2%磷酸溶液（10:90）为流动相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80:20）为流动相B，按规定进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为280 nm。结果：主成分色谱峰与其余杂质色谱峰完全分离，表没食子儿茶素没食子酸酯在1.704～17.04 μg范围内具有良好的线性关系，加样回收率为98.62%，RSD为1.58%；咖啡因在14.2～284.0 ng范围内具有良好的线性关系，加样回收率为98.75%，RSD为0.85%；该测量方法的精密度、重复性、溶液稳定性良好，RSD均小于2%。结论：该测量方法操作简便可靠、重现性好，适用于同时测定心脑健片中表没食子儿茶素没食子酸酯和咖啡因的含量。
关键词：心脑健片；表没食子儿茶素没食子酸酯；咖啡因；HPLC法；含量
0 引言
心脑健片是从纯天然绿茶中提取出茶叶提取物，再通过现代化中药片剂成型工艺制备而成，其主要成分含茶多酚，具有清利头目、醒神健脑、化浊降脂的功效，亦可用于心血管病伴高纤维蛋白原血症及动脉粥样硬化，肿瘤放疗、化疗所致的白细胞减少症的治疗。
茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，在茶叶中的含量一般在20%～35%。其中，儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的65%～80%，儿茶素类化合物主要包括儿茶素（EC）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）4种物质，其各组分含量EGCG为50%～60%、EGC为15%～20%、ECG为10%～15%和EC为5%～10%。EGCG是儿茶素类化合物中含量最高的组分，占绿茶毛重的9%～13%，因为EGCG具有特殊的立体化学结构，所以它具有非常强的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍[1]，能够保护细胞和DNA，免受损害，对氧自由基的清除（抗氧化）能力强，常用作肿瘤多药耐药性的逆转剂，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性，在抗癌和心血管疾病治疗方面担当了重要的角色。
茶叶中的咖啡因具有较强的中枢兴奋作用，在茶多酚的提取制备过程中作为杂质要尽量去除。以往心脑健片的质量控制主要以紫外分光光度法检测茶多酚及咖啡因的含量[2]，为了有效控制心脑健片的产品质量，本文建立了同时测定心脑健片中EGCG和咖啡因含量的方法。
1 仪器与试药
安捷伦Agilent-1100-LC高效液相色谱仪，包括G1311A（四元泵）、G1313A（自动进样器）、G1316A（柱温箱）、VWD检测器、Agilent-1100色谱工作站；分析天平（型号BT125D）。
乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，试验用水为自制纯化水。试验用EGCG对照品、咖啡因对照品由中国食品药品检定研究院提供。心脑健片样品提供单位：花园药业股份有限公司，批号：20180301、20180302、20180303；规格：每片含茶叶提取物0.1 g。空白辅料均符合药用标准。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱（5 μm，200 mm×4.6 mm），品牌为Feini Gen；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10:90）为流动相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80:20）为流动相B，按流动相梯度洗脱表（表1）中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为280 nm。理论板数按EGCG峰计算应不低于3 000，分离度应大于1.5。
2.2 溶液制备
2.2.1 供试品溶液的制备
取样品研细，混匀，取约0.1 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加25%甲醇适量，超声处理（功率160 W，频率40 kHz）30 min，放冷，加25%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.2 对照品溶液的制备
称取EGCG对照品约42.5 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含EGCG 0.85 mg的溶液；称取咖啡因对照品约7 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，再精密量取2.0 mL置于20 mL量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含咖啡因14 μg的溶液。
2.3 检测波长的选择
取上述制备的对照品溶液，用岛津UV-2450型紫外分光光度计在波长200～400 nm处扫描，结果显示EGCG及咖啡因在280 nm波长处有最大吸收值。故以280 nm为检测波长。
2.4 系统适用性试验
在选定的色谱条件下，经HPLC法测定，EGCG、咖啡因和样品中其他组分的色谱峰可达到基线分离，且与其他相邻峰分离度大于1.5，理论板数均在3 000以上。
2.5 标准曲线的测定
精密吸取浓度为0.852 mg/mL的EGCG对照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，分别进样，测定其峰面积积分值，以进样量（ng）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为A=916.077 7C+10 076.854 8，r=0.999 9。结果表明：表没食子儿茶素没食子酸酯在1.704～17.04 μg范围内具有良好的线性关系。
精密吸取浓度为14.2 μg/mL的咖啡因对照品溶液1 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，分别进样，测定其峰面积积分值，以进样量（ng）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为A=346.257 6C+1 462.834 2，r=0.999 8。结果表明：咖啡因在14.2～284.0 ng范围内具有良好的线性关系。
2.6 空白辅料干扰试验
按心脑健片处方组成，取除茶叶提取物外的辅料，按制备工艺要求制成不含茶叶提取物的阴性对照样品。然后，按供试品制备的方法制备阴性对照溶液，分别吸取阴性对照溶液与供试品溶液20 μL进行检测。
结果表明：阴性对照品溶液的色谱中，在与EGCG和咖啡因对照品色谱峰相应位置上无峰，说明空白辅料无干扰。
2.7 精密度试验
精密吸取供试品溶液（20180301），重复进样5次，每次20 μL，分别测定EGCG和咖啡因峰面积，计算得到其RSD分别为0.82%和0.50%。
结果表明：本方法精密度良好。
2.8 重现性试验
按含量测定方法，对同一批样品（20180301）分别制备6份供试品溶液，精密吸取各供试品溶液20 μL注入液相色谱仪进行检测，记录EGCG和咖啡因色谱图与峰面积，EGCG平均含量为39.5 mg/片，其RSD为0.58%；咖啡因平均含量为0.8 mg/片，其RSD为0.62%。
结果表明：本方法重现性好。
2.9 溶液稳定性试验
取“2.2”项下的供试品溶液（20180301）置于室温下放置，于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h分别进样20 μL进行检测，分别记录EGCG和咖啡因色谱图与峰面积，计算得到其RSD分别为1.02%和0.86%。
结果表明：样品在24 h内稳定性良好。
2.10 加样回收率试验
取心脑健片样品（20180301）6份，分别精密称定，再分别加入EGCG和咖啡因对照品，按供试品溶液制备项下的方法测定，记录色谱图，考察本方法的加样回收率。
结果表明：EGCG平均回收率为98.62%，RSD为1.58%；咖啡因平均回收率为98.75%，RSD为0.85%。
2.11 含量测定
各批样品按“2.2”项下方法制备成供试品溶液、对照品溶液，精密量取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算，3批样品的EGCG和咖啡因含量测定结果如表2所示。
根据《药典》规定，心脑健片中EGCG含量应≥36.0 mg/片，咖啡因含量应≤2.0 mg/片。从表2可以看出，3批心脑健片样品中的EGCG和咖啡因含量均符合《药典》规定。
3 结语
（1）流动相及洗脱方法的选择：参考文献[3-4]，本试验分别采用了不同系统的流动相进行试验：乙腈-0.1%磷酸溶液（25:75）、甲醇-0.1%磷酸溶液（28:72）进行等度洗脱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（10:90）为流动相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80:20）为流动相B，按规定进行梯度洗脱50 min。结果表明：以乙腈-0.2%磷酸溶液（10:90）为流动相A、乙腈-0.2%磷酸溶液（80:20）为流动相B，进行梯度洗脱，样品峰与干扰峰完全分开，峰形对称，分离效果最佳。
（2）供试品提取时间的选择：取样品内容物加25%甲醇溶解并稀释至刻度，分别超声处理20 min、30 min、40 min，放冷。分别取供试品加入高效液相色谱仪测定，测定结果表明：样品经超声提取30 min，EGCG和咖啡因的含量不再增加，因此样品超声提取时间定为30 min。
（3）采用HPLC法测定心脑健片中EGCG和咖啡因的含量，在一定的色谱条件下具有良好的稳定性，定量结果重复性好，灵敏度高，专属性强，能较好地控制产品质量。
[参考文献]
[1] 来丽华，葛建.表没食子儿茶素没食子酸酯在小鼠不同组织中体外代谢比较研究[J].中国医药，2016，11（11）：1703-1707.
[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[3] 丁文忠，张承锋.HPLC法测定心脑健胶囊中没食子酰表没食子儿茶素的含量[J].中国中医急症，2007，16（1）：82-83.
[4] 张琪，徐维玲，李翠芹.HPLC法同时测定茶叶中儿茶素类和咖啡因的含量[J].食品工业科技，2015，36（4）：53-56.
作者简介：
付长华（1972—），男，江西抚州人，高级工程师，从事新药研究与开发工作。
