石庆珊 彭永根 安洪伟
国药集团贵州血液制品有限公司
贵州 黔东南 556011
摘 要：目的：了解一定时间内75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。方法：采用75%乙醇对黑曲霉菌菌悬液进行定量杀菌试验，分别用2 mL 75%乙醇对2 mL菌悬液进行作用、4 mL 75%乙醇对4 mL菌悬液进行作用、6 mL 75%乙醇对6 mL菌悬液进行作用、8 mL 75%乙醇对8 mL菌悬液进行作用、10 mL 75%乙醇对10 mL菌悬液进行作用，作用时间为40 min。结果：部分平皿有菌落生长，生长菌落的时间点不同，菌落数均小于菌悬液对照组的2%，通过3组试验结果计算，被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%。结论：75%乙醇对黑曲霉菌有较强的杀灭效果，但在一定时间范围内，黑曲霉菌没有完全被75%乙醇杀灭。
关键词：75%乙醇；菌悬液；黑曲霉菌；杀灭效果
0 引言
75%乙醇是较为常用的消毒液，试验室通常用75%乙醇消毒桌面、台面以及洁净区房间，甚至用75%乙醇浸泡带菌物品。按照2017年版消毒技术规范（2.1.1.9真菌杀灭试验）规定，消毒剂对黑曲霉菌的杀灭对数值≥5.00。黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一种常见真菌，早在2002年版消毒技术规范关于试验指标菌的规定中，黑曲霉菌被定为致病性真菌的代表。鉴于黑曲霉菌培养的特殊性，一些研究者对其进行了检测，并做了有关消毒剂对黑曲霉菌杀灭效果的评价，但对一定时间内消毒剂对黑曲霉菌的杀灭效果评价报道较少。
为了解75%乙醇消毒液在一定时间内对黑曲霉菌的消毒效果，本文对黑曲霉菌菌悬液进行了杀菌试验[1]，以研究75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。
1 仪器与材料
1.1 仪器
电热恒温培养箱，宁波东南仪器有限公司；生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司。
1.2 材料
沙氏葡萄糖琼脂培养基，招远拓普生物工程有限公司；黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，招远拓普生物工程有限公司；0.9%无菌氯化钠溶液，贵州科伦药业有限公司；吐温-80，天津致远化学试剂有限公司；75%乙醇，国药集团贵州血液制品有限公司。
2 试验方法
2.1 黑曲霉菌孢子悬液的制备
首先，取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]冻干菌种管，用麦芽浸膏肉汤培养基进行增菌培养，再经过沙氏葡萄糖琼脂培养基平板划线进行分离培养，选取单个典型菌落接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，在23 ℃条件下培养7天，得到新鲜培养物。然后，取5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下斜面上的孢子，将孢子洗脱。最后，采用无菌注射器吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1 mL含黑曲霉菌孢子数100～200 CFU的孢子悬液备用。
2.2 中和剂的制备
取含20 g/L吐温-80的胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）作为中和剂，能起到有效中和75%乙醇对试验菌的残留作用。
2.3 75%乙醇对黑曲霉菌的杀菌试验
将75%乙醇分装成0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL的消毒液（阳性对照用0.9%无菌氯化钠溶液），置于室温下备用；取分别2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL的黑曲霉菌孢子悬液（黑曲霉菌孢子数100～200 CFU）于5支无菌试管中。然后，用不同体积的75%乙醇分别对5个不同体积的孢子悬液进行作用至预定时间，取0.5 mL菌药混合液加入至4.5 mL的中和剂（含20 g/L吐温-80的TSB）管内。中和作用10 min，取样品液接种进行活菌计数培养，计算杀灭对数值。该试验重复3次。
3 试验结果
上述试验重复做3次，试验结果及分析分别如表1、表2、表3所示。
在表1中，0 mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。2 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；4 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，8 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；10 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35 min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分的黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均匀。因此，在每个时间点都可能会生长黑曲霉菌。另外，35 min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.183%。
在表2中，0 mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。4 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合15 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，6 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20 min后有2个黑曲霉菌菌落生长，6 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；10 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合40 min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，40 min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.283%。
在表3中，0 mL的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均已被大幅度杀灭。2 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；4 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20 min后有1个黑曲霉菌菌落生长，4 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25 min后1个有黑曲霉菌菌落生长，4 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35 min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25 min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8 mL黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20 min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长菌落数均小于菌悬液对照组的2%，生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，35 min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.192%。
通过对上述3次试验结果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，从而计算出每次已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，进而算出已被75%乙醇杀灭的菌落总平均值。综合分析结果如表4所示。
通过重复3次的试验数据统计，75%乙醇对菌悬液作用40 min内，未被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为0.219%。第1次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.817%，第2次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.717%，第3次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.808%，由此可得3次试验已被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%。
4 试验讨论
本次研究重复3次试验，3次试验结果数据有一定的差距，试验全过程均在生物安全柜内进行，需要用的试管、吸管、平皿等器具均通过湿热灭菌后方可使用，试验前开启紫外灯对生物安全柜灭菌消毒20 min，消毒完毕待风机运行30 min后进行试验。3次试验操作人员不变，操作时间、操作人员的动作幅度以及环境等因素，会对试验结果产生一定的影响。
5 结语
本研究结果显示，75%乙醇消毒液对黑曲霉菌的杀灭能力很强。黑曲霉菌作为第四类病原微生物，通常情况下不会引发人类疾病，但会对药品生产检验和环境构成威胁，75%乙醇消毒液能使黑曲霉菌的蛋白质凝固，使其不能形成薄膜，通过酒精持续向其内部渗透并进行消毒杀菌，本试验杀灭效果可达到99.781%。
[参考文献]
[1] 谈智，徐燕，吉钟山，等.八种化学消毒剂对黑曲霉菌杀灭效果的研究[J].中国消毒学杂志，2017，24（1）：41-43.
作者1简介：
石庆珊（1991—），男，贵州黎平人，从事质量检验工作。
作者2简介：
彭永根（1993—），男，贵州锦屏人，从事质量检验工作。
通讯作者：
安洪伟（1968—），男，河南驻马店人，高级工程师，从事试验动物室的日常管理、动物试验、质量检验及试验数据的收集整理分析等工作。
