我们最近又申请了一个新的多重PCR专利，新技术叫dam-PCR (dimer avoided multiplex PCR).
凡是做过PCR的人都知道，当反应到最后的时候会形成系统饱和期（plateau)，扩增产物就不再增加了。一般认为这是多聚酶被PCR产物占据，没有新扩增产物的原因。不过，绝大多数人可能不知道这个系统饱和其实是由两个部分组成的（上图），一部分是想要扩增产物，另一部分是背景扩增和引物双聚体(primer dimer)。在做多重PCR的时候也是如此（中图），有很多靶点是想要扩增的，但是在最后达到饱和期的时候，系统中通常更多的是引物双聚体。如果我们能避免引物双聚体形成（下图），在PCR反应达到饱和期的时候就有更多想要扩增的产物形成了。
所以dam-PCR要解决的问题就是避免引物双聚体的产生。我们在反应的早期就把引物和产物分离，把引物从反应体系中去掉，避免双聚体形成，从而提高了多重PCR的敏感性。dam-PCR除了提高了多重PCR的特异性很敏感性以外，还带来了另外几个好处：（1）定量能力增强，因为我们可以在第一轮反应的时候就给单分子加标记（unique molecular identifier), 这样扩增导致的偏差就能在测序后得到纠正；（2）多重反应设计和优化不再是问题，使得新产品，新应用的研发速度明显提高。（3）降低了测序成本。如果不去掉引物双聚体，至少30%的PCR产物是双聚体，在NGS测序的时候就会浪费掉30%的通量。所以有了dam-PCR做多靶点扩增NGS检测的成本就下降至少1/3.
下面是我最近在台湾讲课用的几张幻灯片：
最理想的多重PCR有上述几个要求：特异性，敏感性好，多重能力强，能定量，多个靶点间扩增均匀，使用方便，研发简单，速度快，价格便宜。dam-PCR的发明似乎满足了所有这些要求。不过，如果没有iCubate全自动技术平台，用手工做dam-PCR还是很麻烦的，因为要用磁珠做三次引物清除。
为什么多重PCR这么难做？首先，每个引物的设计都是一个挑战；针对每个靶点的每对引物扩增条件要协调；背景扩增要少；引物双聚体要避免。
针对每一个难关，我们（或者他人）都研发出了一些解决方案：（1）我们发现多聚酶针对不同的引物和模版有不同的亲和性，并开发出软件利用这个亲和性的不同来设计更好的引物。（2）针对多靶点之间扩增条件不兼容的问题，我们研发出了tem-PCR, arm-PCR等技术。（3）针对背景扩增的问题，韩国SeeGene公司有一个长引物扩增方法；（4）针对引物双聚体的问题，我们现在又有了 dam-PCR 技术。
在IT行业，有硬件，操作系统，应用软件的分类；相对应的，在生物技术领域也有硬件，系统软件，和应用三个档次。和普通PCR, qPCR, NGS 一样，多重PCR技术是一个平台技术。所谓平台技术就是能衍生出许多应用的，类似于系统软件的强大技术。
虽然高通量测序技术效力效率越来越高，多重PCR技术还是大有用武之地，因为测序技术本身不能解决分子诊断的核心问题：提高信噪比。把标本中所有的核酸都测序了，得到的毕竟大都是噪音。经过多重PCR技术做靶向扩增，能够突出临床需要的信号，滤去不必要的背景信号。有了强大的多重PCR技术，才会有更多的分子鉴别诊断产品出台。精准医疗，诊断为先。没有多重，就没有鉴别诊断，没有鉴别诊断，精准医疗就无从谈起。
说“一不小心，又创新了”，意思是这个发明来得很突然。一月份的一篇博客还在谈“赏酶”，强调生物技术创新应该在酶上面下功夫，现在又有新突破，是偶然中的必然？事情是这样的，我们在开发iPair+产品的时候，做单细胞测序，每个细胞的基因表达图谱都不同，于是多重PCR的引物使用率就不同，那些“没活干”的引物总是很快形成引物双聚体，占据多聚酶，导致多重扩增敏感性大大降低。我们本以为引物双聚体可以通过小心的引物设计来避免，结果发现双聚体的形成是几乎不可避免的。引物双聚体的问题，如果不去仔细研究（我们把单细胞测序过程中产生的引物双聚体做了NGS）就不知道这个问题的严重性，也就不会去设法解决这个问题了。使用dam-PCR技术以后，单细胞扩增测序的效果非常好。这个新发明具有巨大的商业价值，因为我们可以在这个平台技术上开发出许许多多的产品，所以我们也在第一时间申请了专利保护。
PCR技术被发明已经30多年了，我们还能从中找到这么多创新的机会，这让我庆幸之余也很茫然：是否还有很多我们忽略了的问题？是否还有更多创新的机会？都说机遇是给有心人准备的，可是我们专注于多重PCR的研究十多年了，为什么今天才注意到这个这么明显的（引物双聚体）问题？
