【技术规范】基于快速现场评价的诊断性介入肺脏病学标准取材技术

冯靖¹，周国武²，李雯^3△，孟晨^4△，周红梅^5△，李彩丽¹，曹洁¹

      摘要：将快速现场评价（ROSE）技术与介入诊断有机结合，可构建完整的“基于快速现场评价的诊断性介入肺脏病学”体系。在ROSE辅助下，改变介入诊断操作的方式、方法和手段以获取靶病灶，是该体系的核心环节。本文详细介绍了“基于快速现场评价的诊断性介入肺脏病学”体系中最常使用的标准取材技术，包括双铰链刮匙操作技术、经支气管肺活检（TBLB）技术和经支气管刷检技术。

       关键词：细胞学；微生物学；病理学；放射摄影术，介入性；快速现场评价；介入呼吸病学

中图分类号：R563　　文献标志码：A　　DOI：10.11958/20170514

The Standard Operating Techniques for Diagnostic Interventional Pulmonary Based on Rapid on-site Evaluation

FENG Jing¹, ZHOU Guo-wu², LI Wen^3△, MENG Chen^4△, ZHOU Hong-mei^5△, LI Cai-li¹, CAO Jie¹

1 Department of Respiratory, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China; 2 Department 3 of Pulmonary and Critical Care Medicine, China-Japan Friendship Hospital; 3 Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine; 4 Department of Respiratory Interventional medicine, Qilu Childern’s Hospital of Shandong University; 5 Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Affiliated Zhongshan Hospital of Guangdong Medical University

△Corresponding Author LI Wen E-mail: liwenzjhz0408@163.com; MENG Chen E-mail: mengchen.6666@163.com; ZHOU Hong-mei E-mail: zhouhongmei2011e@163.com

        Abstract: With the organic combination of rapid on site evaluation (ROSE) and interventional pulmonary diagnosis technology, we can build a complete “The System of Diagnostic Interventional Pulmonary Based on Rapid on-site Evaluation”. With the help of ROSE, changing the ways, methods and modalities of interventional pulmonary diagnosis technology to obtain the target lesions is the core of this system. In this statement, the most commonly used standard operating techniques in “The System of Diagnostic Interventional Pulmonary Based on Rapid on-site Evaluation” are described in detail, including double-hinge curette operating technique, 

transbronchial lung biopsy (TBLB) technique, and transbronchial brushing technique.

    Key word: cytology; microbiology; pathology; radiography, interventional; rapid on site evaluation; interventional pulmonology

       肺癌和下呼吸道耐药病原菌感染患病率的增加，以及疑难病与呼吸危重症在诊断层面的迫切需求，促进了诊断性介入肺脏病学的蓬勃发展，使介入诊断能力成为评价一个呼吸或肿瘤中心综合实力的重要参考指标。本文将详细介绍“基于快速现场评价（rapid on site evaluation，ROSE）的诊断性介入肺脏病学”体系中最常用的取材技术，以及如何将这些技术与ROSE结合应用。

1.1　双铰链刮匙的技术参数　以CC-6DR-1（Olympus, Tokyo, Japan）为例：属性为双关节型；工作长度1 150 mm；适用工作孔道＞2.0 mm；插入部最大外径1.5 mm；方向可旋转；适用内镜工作长度＜600 mm。

1.2　刮匙与防污染刮匙的技术优势　（1）双铰链刮匙操作简单，标本容易制片，适用于便携支气管镜。其最大技术优势在于可弯曲性和柔韧性，这使刮匙较容易进入“直型”活检钳或细胞刷因弯曲角度不及而不能进入的靶支气管^［2-3］。（2）刮匙插入部外径1.5 mm，其先端外径仅1.2 mm，且先端可弯曲。而普通细胞刷的刷毛蓬开后，其先端外径可达2.5~3.0 mm。刮匙与防污染刮匙可到达比普通细胞刷更深在的亚段和更远级别的靶病灶细支气管、呼吸性细支气管甚至肺组织。所以，刮匙与支气管肺活检（TBLB）标本的相关性和一致性就较好。（3）即使是非防污染刮匙，相比于普通细胞刷，污染口腔和中心气道的可能都较小。普通细胞刷在工作孔道和气道内行进中会沾染拖带大量分泌物，形成污染。（4）如靶病灶松脆或坏死明显，刮匙有时可获得组织学标本，而普通细胞刷则不可获得组织学标本。（5）较之TBLB，刮匙与防污染刮匙的技术优势是并发症发生率低，可将气胸、致死性出血、空气栓塞等并发症的发生率控制在更低水平^［3］，可轻松用于蜂窝肺、间质性肺疾病、轻度血小板减少或凝血功能障碍、珍贵儿以及并发症承受能力低下的患者，更适用于重症医学领域，尤其是机械通气中的患者。（6）作为一种细胞学载体，ROSE具备的功能包括：评价取材满意度、实时指导介入操作手段与方式、形成初步诊断或缩窄鉴别诊断范围、优化靶部位标本进一步处理方案、结合全部临床信息与细胞学背景进行病情分析与转归预判^［1］。而多数情况下刮匙与防污染刮匙在刮匙杯中刮得的内容为细胞学标本，肉眼见不到成形组织，决定了刮匙与ROSE或其他细胞学检查结合使用可发挥更大的技术优势。（7）刮匙取材具有较高的阳性率，在X线透视辅助下，其细胞学阳性率可达97.8%^［3］；刮匙洗液所获得的细胞学标本足以用于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、Kirsten大鼠肉瘤反转录病毒原癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）和P53基因等的分析^［4］。（8）就取材满意度来讲，刮匙处于TBLB和刷检之间，术者应根据患者和病灶的具体情况选择单独或联合使用TBLB、刮匙或刷检。

1.3　非经导向鞘双铰链刮匙的操作　（1）调整内镜方向与插入深度，尽量向靶支气管深处部署，向靶支气管开口及附近喷洒或滴注适量局麻药物。（2）将内镜退回中心气道；助手调直刮匙，将刮匙送入工作孔道，术者推送刮匙直至其前出工作孔道，并于显示器视及刮匙先端。应注意，与活检钳和细胞刷不同，刮匙先端圆滑，前出工作孔道出口时缺乏顿挫感，应在刮匙先端接近工作孔道出口时放缓推送速度，避免迅速前出损伤腔内黏膜或远端肺组织。（3）前出刮匙全部可弯曲工作部，在腔内前进或后退并反复弯曲刮匙，以调节并确认刮匙弯曲角度与朝向位置。（4）调整刮匙朝向点，将刮匙先端送入靶支气管，先端一旦进入靶支气管开口，助手即应伸直刮匙以利刮匙继续向靶支气管远端深入推送。（5）尽量轻柔地向靶支气管远端推送刮匙至有阻力，再以韧力尝试推送刮匙直至其不能再深入，注意切勿使用暴力，避免造成刮匙远端组织损伤、气胸或出血。在此过程中，如遇患者咳嗽较剧或呼吸动度过大，当暂缓进一步操作并回撤刮匙，同时采取喷洒或滴注适量局麻药物、增加镇痛镇静深度等应对措施。（6）确认刮匙到达靶支气管最远端不能再推进时，助手做轻度韧力的弯曲刮匙动作，使双绞链刮匙先端前关节轻度弯曲。而后，术者以缓韧力量短距离回提和前送刮匙，反复数次以完成刮取。（7）助手轻柔地伸直刮匙，术者缓缓回撤刮匙，于显示器看到刮匙确实处于伸直状态再撤入工作孔道并迅速回收。（8）应注意在所有伸直刮匙动作中，都切勿过度用力，以避免刮匙反张（过伸）。刮匙在工作孔道中前进或后退时，助手切勿做任何动作以避免刮匙打弯或反张而损伤工作孔道。（9）所有上述操作中，均应注意避免可能发生的标本污染。（10）可重复多次上述操作，在多次操作中，更应注意如标本污染可造成微生物培养假阳性。

1.4　刮匙操作中标本的留取　（1）应知晓在多数情况下，刮匙杯中刮得的内容为细胞学标本，肉眼见不到成形组织，但这并不影响细胞学制片和微生物标本的留取。（2）ROSE细胞学制片。回收刮匙，将刮匙先端抵于无菌细胞学专用玻片（须具较强细胞附着性）染色端1/3处，以无菌细注射器（2.5 mL或5.0 mL）针尖将刮匙杯中刮得的内容挑出并涂在细胞学专用玻片上，须薄厚适度。即刻交与助手进行ROSE染色。（3）组织病理留取。在组织松脆或坏死较多时，刮匙杯中可刮得肉眼可见的小组织粒标本，此时应以无菌细注射器针尖将刮匙杯中标本挑出，置于吸水纸上，福尔马林固定，送检组织病理。同时包括肿瘤学相关检查，如免疫组织化学、聚合酶链反应（PCR）、染色体荧光原位杂交（FISH）、电子显微镜检查以及微生物学相关检查，如抗酸染色等。（4）在感染性疾病中，如刮得肉眼可见的小组织粒标本，可用无菌细注射器针尖将刮匙杯中标本挑出，直接涂于微生物培养皿上。如多次刮得组织粒标本，可将其集中一起，进行组织研磨培养；如不能刮得可见标本，可将刮匙先端在微生物培养皿上涂抹或置于少量灭菌生理盐水中浸泡并抖动，并将该盐水标本进行微生物检验。

1.5　防污染刮匙的制备与操作　（1）将刮匙套入无菌毛刷导管，用K201卡口（Olympus, Tokyo, Japan）将刮匙固定在导管内的合适位置，使刮匙先端距导管出口约5 mm。再以分析纯高温灭菌后的聚乙二醇4 000于约52 ℃封闭导管先端约3 mm，制成防污染刮匙，其后的操作要点大致同上。（2）防污染刮匙使用时，应注意将无菌毛刷导管和固定刮匙的K201卡口共同推送，前出工作孔道于显示器看到导管先端后，后移K201卡口，固定导管，单独推出刮匙，进行相应后续操作。（3）操作完成后，将刮匙收回导管内，推回K201卡口，仍将刮匙固定在导管内的合适位置，使刮匙先端距导管出口约5 mm；再将导管与K201卡口连同刮匙共同撤退回收；其他相应后续操作要点大致同上。K201卡口经消毒灭菌后可反复使用。

       TBLB技术是诊断性介入肺脏病学中最基本、最常用，也是非常确切有效的操作技术^［5-6］。基于ROSE的TBLB技术对以下肺部疾病（病变）的诊断或鉴别诊断有较大提示价值：（1）大部分常见类型实体恶性肿瘤。（2）结核病。（3）结节病。（4）部分支原体肺炎。（5）部分病毒性肺炎。（6）部分真菌，如曲霉菌、隐球菌、孢子菌及念珠菌感染。（7）机化性肺炎或机化性改变（即机化）或纤维化。（8）化脓性感染。（9）坏死性感染或坏死性改变（即坏死）。（10）部分变态反应性疾病或变态反应性改变。（11）部分免疫性疾病（如某些类型血管炎）或免疫性改变。（12）其他，如化疗后免疫重建相关改变或肺移植术后相关改变^［1］。TBLB安全性较高，大多可在非X线透视辅助下完成^［7］。文献报道其气胸并发率可低至0.97%，需引流气胸的并发率更低，仅0.55%，操作相关出血的并发率可低至0.58%^［8］，而脑部空气栓塞等其他并发症极其罕见^［9-10］。

2.1　“冯氏六步法”常规TBLB技术的优势　（1）常规TBLB原则上无需患者主动呼吸配合，但“顶住咬实”这一步（见2.2）尽量在患者呼气相而非吸气相进行。适用于儿科、全身麻醉、深度镇静与其他患者不能主动配合的情况。（2）操作中不追求突破感，良好掌握时，气胸与致死性出血发生率极低；因为是在无突破感情况下取材，所获标本既有肺组织，也包含部分远端细支气管黏膜和黏膜下组织，方便全面评价。（3）常规TBLB适合与ROSE集成使用，制得ROSE印片包含各层细胞内容，清晰明亮。染色后色彩鲜艳，分布均匀，容易判读。集成ROSE后，常规TBLB得到实时质量控制和操作方式方法的实时修正与指导，以确保取材精确可靠，适可而止。（4）常规TBLB操作柔和、易学易用，高效安全，不仅适用于外周肺肿瘤性疾病的取材，更适用于外周肺感染性病灶标本采集。

2.2“冯氏六步法”常规TBLB技术的操作　（1）柔韧部署。经软性支气管镜向靶支气管部署鳄齿钳（非圆杯平齿钳），感觉或看到钳头前出工作孔道后，放慢前出部署速度，根据术前CT、虚拟支气管镜导航或手绘支气管导航路径，将鳄齿钳送入靶支气管开口，以一股柔韧的力量向靶支气管远端尽量深入部署。注意，不宜用过大力量，尤其不要用暴力，而用韧力，勿一味寻求突破感。（2）灵敏感觉。以操作手无名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控鳄齿钳，以韧力缓慢地往复推进和回撤鳄齿钳，耐心细致地用指端去感觉鳄齿钳先端顶在“如触口唇”般的肺脏或“如触鼻尖”般的远端细支气管（握住感），而非“如触前额”般的远端支气管尖嵴。注意，如指端感觉为远端支气管尖嵴，应以韧力调整活检钳避开、滑过、更换靶支气管亚段或重新部署。（3）往复开钳。感觉鳄齿钳先端顶在肺脏或远端细支气管后，助手以韧力做完全打开或部分打开鳄齿钳的动作；此时，因远端细支气管从四周握住活检钳先端，钳杯不易张开，术者应以韧力缓慢地往复推进和回撤鳄齿钳，借助钳头与周围的摩擦力和空间以辅助尽量打开钳杯；借助往复开钳动作，还可能将靶支气管深部的细支气管远端部位（即鳄齿钳先端以远部位）的黏膜部分“撕裂”，从而暴露更多肺组织。注意，熟练掌握的术者可将该步骤与第2步合并完成。助手做开钳动作要韧力而坚决，待术者做往复推进和回撤动作时，如钳杯打开，助手应有相应的手上感觉。（4）顶住咬实。感觉鳄齿钳钳杯打开后，术者以操作手无名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控鳄齿钳，以柔韧的力量向前顶住鳄齿钳，使钳杯“扣”严组织，助手以韧力坚决地咬实鳄齿钳，尽量把组织咬入钳杯。注意，该步骤原则上无需患者主动呼吸配合，但“顶住咬实”这一步尽量在患者呼气相而非吸气相进行。助手“咬实”时应尽量坚决，而不是单纯的动作“快”。（5）缓韧撕扯。钳杯咬实组织后，术者以操作手无名指抵住工作孔道入口，以拇指、食指和中指把控鳄齿钳，以韧力后撤鳄齿钳，体会所谓“手撕牛肉感”直至有“断裂感”或后撤达一定距离，确认咬实的组织已被撕下。（6）回收标本。确认咬实的组织已被撕下后，助手应迅速回撤并回收鳄齿钳，术者待鳄齿钳完全退出工作孔道后应立即盖严工作孔道封帽，仔细观察并处理可能发生的出血。注意，迅速倒退回撤时必先确认咬实的组织已被撕下，避免形成暴力撕扯。在任何步骤中，如患者主诉相应部位有疼痛，都要终止操作。可稍回撤鳄齿钳然后取材、更换靶支气管亚段或重新部署鳄齿钳。

2.3　常规TBLB操作中标本的留取

2.3.1　应优先满足组织病理学检查所需标本的质量和数量　（1）常规TBLB取材3~4粒，每粒取材均需ROSE印片。靶部位取材时，用一次性2.5～5.0 mL注射器针头将组织粒从活检钳钳杯中挑起，在基本不损失组织标本的前提下，在无菌细胞学专用玻片（须具较强细胞附着性）染色端1/3处自内向外涂抹出直径约1 cm的圆形，须薄厚适度。然后，实时将印片交与助手进行ROSE染色与判读，并将印片后的组织粒置于无菌吸水纸片上，放入预装1.5 mL 10%福尔马林的2 mL微量离心管，仍按常规方式送检组织病理学。（2）根据ROSE判读结果调整常规TBLB操作方式、方法。争取即刻诊断，缩窄鉴别诊断范围或结合临床信息研判病情，不仅为临床医师制定诊疗方案提供重要参考，还可辅助选择靶标本的下一步处理方式，包括肿瘤学相关检查，如免疫组织化学、PCR、FISH、电子显微镜检查等，微生物学相关检查，如特殊染色、组织研磨培养等，并辅助选择进一步操作手段。

2.3.2　组织学微生物培养　满足组织病理学检查取样要求后，继续取材进行组织学微生物培养。常规TBLB继续取材2~4粒，每粒取材均需ROSE印片。然后，实时将印片交与助手进行ROSE染色与判读（见2.3.1）；并将印片后的组织粒进行如下处理：（1）“组织研磨液”培养。置于无菌吸水纸片上，放入预装有少量生理盐水的1 mL灭菌微量离心管，送检验科行“组织研磨液”培养。（2）“组织增菌”培养。用一次性2.5~5.0 mL注射器针头将组织粒从活检钳钳杯中挑起，“塞入”一次性斜面型20 mL或60 mL注射器针头内，然后将该“粗针”针头刺入血培养瓶中，针头后方用针筒空气加压，将该组织粒“吹入”血培养瓶。注意，染色后的ROSE制片如需用于其他检测，例如FISH、免疫细胞化学、激光微俘获等，应以无水乙醇脱色15~30 min。

3.1　二次防污染毛刷经支气管刷检术　以“冯氏防污染细胞刷（江苏常州久虹/唯德康医疗器械有限公司）”为例

3.1.1　二次防污染毛刷的技术优势　（1）双套管设计，能较可靠地防污染^［11-12］。内管与外管均处于完全封闭状态，且内管与外管彼此间不交通。外管由封口薄膜封堵，内管一旦前出，封口薄膜仅松解而不会掉落。内管由共轴金属头封闭，借助内管的弹性进行封堵，刷头前出时即解除封堵；外管主要隔绝内镜工作孔道内来自上呼吸道和主气道的污染；内管与共轴金属头的封闭主要隔绝来自主气道和段/亚段支气管的污染。刷检完毕刷头回撤时，共轴金属头将刷头封闭于内管，避免刷检标本于回收毛刷时受污染。（2）兼容2.0 mm内镜工作孔道，适用性强，能适配包括细软性支气管镜（如BF-P-260F；Olympus, Tokyo, Japan）在内的多数呼吸内镜，并可与虚拟导航和外周径向超声系统等设备结合使用，使刷检更精确^［13］。（3）作为细胞学载体，二次防污染毛刷的ROSE刷片具备全部细胞学功能，可评价取材满意度、形成初步诊断或缩窄鉴别诊断范围、结合全部临床信息与细胞学背景进行病情分析与转归预判^［1］；防污染毛刷获得标本均为细胞学标本，决定了其与ROSE或其他细胞学检查结合使用可发挥更大技术优势。（4）刷头细毛软硬合理，取材量大，也比较适合细胞学制片。

3.1.2　二次防污染毛刷的操作　（1）封闭内管。撕去手环固定贴，一手固定内管手柄，另一手向后拉动手环，将防污染毛刷刷头撤回内管内，借助内管的弹性以共轴金属头封闭内管。（2）部署毛刷。经软性支气管镜，将防污染毛刷整体部署到准备取材的靶支气管的上一级支气管，整体前出毛刷，于显示器看到外管先端。（3）内管前出。一手固定外管手柄，另一手向前推动内管手柄，使内管先端突破外管封口薄膜的封堵，前出至外管先端之前至少1.5 cm。（4）部署内管。调整毛刷角度方向，固定内、外管手柄，使毛刷在内管前出的状态下整体缓缓推进，依据影像学判断或在虚拟导航、径向超声等的引导下，将毛刷整体送入靶支气管开口，并将毛刷柔韧地尽量向靶支气管远端推送深入。（5）刷头刷检。一手固定内管手柄，另一手向前推动手环，使防污染毛刷刷头前出，反复推拉手环进行刷检，完成刷检后回撤手环，使防污染毛刷刷头回到内管内，借助内管的弹性以共轴金属头封闭内管。（6）回撤内管。术者固定外管手柄，留外管于软性支气管镜工作孔道内，助手完全后撤回收内管和刷头，留取标本。（7）随弃外管。将外管抽出，回收，弃去。

3.2　超细细胞刷经支气管刷检术　以“冯氏超细细胞刷（天津亚森特医疗科技有限公司）”为例。

3.2.1　超细细胞刷（针刷）的技术优势　（1）超细细胞刷，因其尖端极其纤细，又名“针刷”。其刷体导管外径仅0.9~1.0 mm，内部盘旋导丝构成的刷头先端直径仅0.4 mm。对成人患者，针刷可部署至较为远端深入的靶支气管，稍用力部署时可非常深入。对儿童患者，可经内径1.2 mm工作孔道的内镜部署。针刷质地柔韧，较容易部署至双上叶尖段等需要较大弯曲角度方能部署的叶段。（2）操作简便，易学易用，便于普及，取材效果确切并安全，较之TBLB，针刷操作时并发需引流的气胸和致死性出血的概率更低^［11-12］。（3）针刷可部署至非常深入的靶支气管，故其ROSE细胞学制片和种植培养皿微生物培养的效果应与TBLB接近，从而在一定程度上或可规避TBLB的风险。（4）作为细胞学载体，针刷的ROSE刷片具备全部细胞学功能，可评价取材满意度、形成初步诊断或缩窄鉴别诊断范围、结合全部临床信息与细胞学背景进行病情分析与转归预判^［1］。针刷获得的标本均为细胞学标本，决定了针刷与ROSE或其他细胞学检查结合使用可发挥更大的技术优势。（5）采用聚乙二醇4000（聚乙二醇可在水中缓慢溶解，在乙醚或乙醇中不溶，溶点为50~54 ℃）。封堵针刷导管先端，可制成防污染针刷，再结合ROSE细胞学印片判读与种植培养皿微生物培养，便于疑难病与危重症的评估和诊治方案的制定^［11-12］。

3.2.2　针刷的操作　（1）柔韧部署。经软性支气管镜部署针刷，见到针刷先端前出工作孔道后即缓缓推进，依据影像学判断或在虚拟导航、径向超声等的引导下，将针刷先端送入靶支气管开口，并将针刷柔韧地尽量向靶支气管远端推送深入。注意，与TBLB活检钳（鳄齿肺活检钳先端坚硬圆钝）不同，针刷先端纤细却锋利，易卡住而不能突入狭窄闭塞的远端支气管，向靶支气管远端推送深入时，切忌粗暴，须缓慢、稳健、柔韧地操作针刷；不推荐向闭塞的远端支气管强行推入，应知难而退，更换靶支气管再试向远端推送深入。（2）仔细感觉。术者以操作手无名指抵住工作孔道入口，以操作手拇指、食指和中指把控针刷，以韧力缓慢地往复推进和回撤针刷，耐心细致地用指端去感觉针刷先端顶在靶支气管远端的感觉，并体会其深度，以求尽量向靶支气管远端推送深入。（3）退后推刷。感觉到针刷先端顶在肺组织或远端细支气管后，术者把控针刷导管，将其回撤约0.5 cm；然后，助手缓慢、柔韧地推送针刷导丝使刷头前出进行刷检，完成后回撤导丝，收回刷头。注意，针刷导丝先端纤细，推送刷检时切忌粗暴，刷检时仅做1次推送和回撤即完成刷检。（4）回收针刷。回撤导丝，收回刷头后迅速回收针刷，留取标本。

3.3　刷检中标本的留取　针刷刷检回收后可直接推出刷头，留取标本。对二次防污染毛刷，仅回收内管，以无菌剪刀将导丝金属头连同部分内管先端一起剪掉弃去，再推出刷头并留取标本。

3.3.1　刷片（涂片）　将刷头推出，在无菌细胞学专用玻片（须具较强细胞附着性）染色端1/3处往复涂抹出约2 cm×1 cm的长方形，须薄厚适度。每次刷检建议涂片3张。可多次刷检以获得3张以上的涂片。涂片可送检以下项目：（1）第1张涂片应立即进行ROSE染色，并“迅速实时”转到专用显微镜进行综合分析（判读）。因为制片、染色耗时极短，使ROSE判读过程几乎与介入操作过程形成实时反馈。细胞学判读所获印象是综合分析病情时不可或缺的信息。（2）ROSE片基作为细胞学载体，不仅能用于细胞学判读，其本身还是细胞得以保存和用于研究的宝库。所有能基于细胞的分子生物学和基因技术均可利用ROSE片基得以开展，包括PCR、FISH、免疫细胞化学、二代基因测序等^［1］。（3）送检细胞病理学，行苏木素-伊红（HE）染色，观察细胞形态，综合分析病情，亦可进行其他细胞学检验。（4）革兰染色寻找细菌（球菌、杆菌）以及菌丝（丝状真菌、假丝）和孢子等病原微生物。因为曲霉菌等丝状真菌在下呼吸道很少定植，在影像学和临床均符合时，经软性支气管镜在防污染条件下取得真菌证据则高度提示感染而非污染或定植^［14-15］。（5）特殊染色如抗酸染色（结核分枝杆菌、奴卡菌）、六胺银染色（真菌）、过碘酸雪夫（Periodic acid-Schiff, PAS）染色（真菌）、氢氧化钾（KOH）染色（真菌）、金胺O-罗丹明染色（结核分枝杆菌、奴卡菌）、乳酸酚棉兰染色（真菌）等，以明确相应的病原微生物。（6）特殊染色如刚果红染色（淀粉样物）、油红O染色（脂类），以明确相应的病因。

3.3.2　种植培养皿微生物培养　将推出的刷头直接涂抹于沙保弱培养皿或血平板培养皿，行病原微生物种植培养。

3.3.3　刷头洗液　用无菌剪刀将刷头剪入预装1 mL无菌生理盐水的2 mL的微量离心管内，扣严封盖，剧烈振荡，将振荡形成的刷头洗液直接行病原微生物培养。或将刷头洗液高速离心，将沉渣制片或用于细胞学检验。

参考文献

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（2017-04-26收稿　2017-04-30修回）　

（本文编辑　魏杰）