高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography/HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。今天,小析姐就来和你说说HPLC实验过程中经常会遇到的那些问题吧!
操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象,并在右侧的列表中参考相应的解决方法。
A.没有压力显示,没有流动相流动
原因 |
解决方法 |
1.电源问题 |
1.接通电源,开机 |
2.保险丝被烧坏 |
2.更换保险丝 |
3.控制器设定不正确或设定失败 |
3.a.采取恰当的设定 b.修理或更换控制器 |
4.柱塞杆折断 |
4.更换柱塞杆 |
5.泵头内有空气 |
5.溶剂脱气、启动泵抽出空气 |
6.流动相不足 |
6.a.补充流动相 b.更换入口滤头 |
7.单向阀损坏 |
7.更换单向阀 |
8.漏液 |
8.拧紧或更换手紧接头 |
B.流动相流动正常,但没有压力显示
原因 |
解决方法 |
1.仪表损坏 |
1.更换仪表 |
2.压力传感器损坏 |
2.更换压力传感器 |
C.压力持续偏高
原因 |
解决方法 |
1.流速设定过高 |
1.调整流速设定 |
2.柱前筛板堵塞 |
2.a.在允许情况下反冲色谱柱 b.更换筛板 c.更换色谱柱 |
3.流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 |
3.a.使用恰当的流动相 b.冲洗色谱柱 |
4.色谱柱选择不当 |
4.选择恰当的色谱柱 |
5.进样阀损坏 |
5.清洗或更换进样阀 |
6.柱温过低 |
6.提高温度 |
7.控制器失常 |
7.修理或更换控制器 |
8.保护柱阻塞 |
8.清洗或更换保护柱 |
9.在线过滤器阻塞 |
9.清洗或更换在线过滤器 |
D.压力持续偏低
原因 |
解决方法 |
1.流速设定过低 |
1.调整流速 |
2.系统漏液 |
2.确定漏液位置并维修 |
3.色谱柱选择不当 |
3.选择恰当的色谱柱 |
4.柱温过高 |
4.降低温度 |
5.控制器失常 |
5.维修或更换控制器 |
E.压力不断上升
原因 |
解决方法 |
1.见列表C |
1.见列表C |
F.压力降为零
原因 |
解决方法 |
1.见列表A、B |
1.见列表A、B |
G.压力不断下降,但不回零
原因 |
解决方法 |
1.见列表D |
1.见列表D |
H.压力波动
原因 |
解决方法 |
1.泵中有气体 |
1.a.溶剂脱气 b.从泵中除去气体 |
2.单向阀损坏 |
2.更换单向阀 |
3.泵密封损坏 |
3.更换泵密封 |
4.脱气不充分 |
4.a.溶剂脱气 b.改变脱气方法(使用在线脱气法等) |
5.系统漏液 |
5.确定漏液位置并维修 |
6.使用梯度洗脱 |
6.由于流动相粘度的变化引起的压力波动 |
通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题,但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题,就必须将接头取下,检查是否损坏(例如,卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。
A.接头处漏液
原因 |
解决方法 |
1.接头松动 |
1.拧紧 |
2.接头磨损 |
2.更换 |
3.接头过紧 |
3.a.拧松,再重新拧紧 b.更换 |
4.接头被污染 |
4.a.拆下清洗 b.更换 |
5.部件不匹配 |
5.使用同一品牌的配件 |
B.泵漏液
原因 |
解决方法 |
1.单向阀松动 |
1.a.拧紧单向阀(不必拧的过紧) b.更换单向阀 |
2.接头松动 |
2.拧紧接头(不必拧的过紧) |
3.混合器密封损坏 |
3.a.更换混合器密封 b.更换混合器 |
4.泵密封损坏 |
4.维修或更换泵密封件 |
5.压力传感器损坏 |
5.维修或更换压力传感器 |
6.脉冲阻尼器损坏 |
6.更换脉冲阻尼器 |
7.比例阀损坏 |
7.a.检查隔膜,如果漏液立即更换 b.检查手紧接头,损坏的立即更换 |
8.放空阀的损坏 |
8.a.拧紧放空阀 b.更换放空阀 |
C.进样阀漏液
原因 |
解决方法 |
1.转子密封损坏 |
1.重新安装或更换进样阀 |
2.定量环阻塞 |
2.更换定量环 |
3.进样口密封松动 |
3.调整 |
4.进样针头尺寸不合适 |
4.使用恰当的进样针 |
5.废液管中产生虹吸 |
5.保持废液管高于废液液面 |
6.废液管阻塞 |
6.更换或疏通废液管 |
D.色谱柱漏液
原因 |
解决方法 |
1.尾端接头松动 |
1.拧紧接头 |
2.卡套内有填料 |
2.拆下、清洗卡套、重新安装 |
3.筛板厚度不合适 |
3.使用合适的筛板(参考下表) |
※筛板选择指导
物质粒径 |
筛板孔径 |
3-4u |
0.5u |
5-20u |
2u |
E.检测器漏液
原因 |
解决方法 |
1.流通池垫片损坏 |
1.a.避免过大的背景压力(压力降) b.更换垫片 |
2.流通池窗破碎 |
2.更换窗口 |
3.手紧接头漏液 |
3.拧紧或更换 |
4.废液管阻塞 |
4.更换废液管 |
5.流通池阻塞 |
5.重新安装或更换 |
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来,其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A.峰拖尾
原因 |
解决方法 |
1.筛板阻塞 |
1.a.反冲色谱柱 b.更换进口筛板 c.更换色谱柱 |
2.色谱柱塌陷 |
2.填充色谱柱 |
3.干扰峰 |
3.a.使用更长的色谱柱 b.改变流动相或更换色谱柱 |
4.流动相pH选择错误 |
4.调整pH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰 |
5.样品与填料表面的溶化点发生反应图 |
5.a.加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b.更改色谱柱 |
B.峰前延
原因 |
解决方法 |
1.柱温低 |
1.升高柱温 |
2.样品溶剂选择不恰当 |
2.使用流动相作为样品溶剂 |
3.样品过载 |
3.降低样品含量 |
4.色谱柱损坏 |
4.见A1、A2 |
C.峰分叉
原因 |
解决方法 |
1.保护柱或分析柱污染
|
1.取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。 |
2.样品溶剂不溶于流动相 |
2.改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。 |
D.峰变形
原因 |
解决方法 |
1.样品过载 |
1.减少样品载量 |
E.早出的峰变形
原因 |
解决方法 |
1.样品溶剂选择不恰当 |
1.a.减少进样体积 b.运用低极性样品溶剂 |
F.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原因 |
解决方法 |
1.柱外效应 |
1.a.调整系统连接(使用更短、内径更小的管路); b.使用小体积的流通池; |
G.K’增加时,脱尾更严重
原因 |
解决方法 |
1.二级保留效应,反相模式 |
1. a.加入三乙胺(或碱性样品) b.加入乙酸(或酸性样品) c.加入盐或缓冲剂(或离子化样品) d.更换一支柱子 |
2.二级保留效应,正相模式 |
2. a.加入三乙胺(或碱性样品) b.加入乙酸(或酸性样品) c.加入水(或多官能团化合物) d.试用另一种方法 |
3.二级保留效应,离子对 |
3.加入三乙胺(或碱性样品) |
H.酸性或碱性化合物的峰拖尾
原因 |
解决方法 |
1.缓冲不合适 |
a.使用浓度50-100mM的缓冲液 b.使用Pka等于流动相pH值的缓冲液 |
I.额外的峰
原因 |
解决方法 |
1.样品中有其他组份 |
1.正常 |
2.前一次进样的洗脱峰 |
2. a.增加运行时间或梯度斜率 b.提高流速 |
3.空位或鬼峰 |
3. a.检查流动相是否纯净 b.使用流动相作为样品溶剂 c.减少进样体积 |
J.保留时间波动
原因 |
解决方法 |
1.温控不当 |
1.调好柱温 |
2.流动相组分变化 |
2.防止变化(蒸发、反应等) |
3.色谱柱没有平衡 |
3.在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 |
K.保留时间不断变化
原因 |
解决方法 |
1.流速变化 |
1.重新设定流速 |
2.泵中有气泡 |
2.从泵中除去气泡 |
3.流动相选择不恰当 |
3. a.更换合适的流动相 b.选择合适的混合流动相 |
L.基线漂移
原因 |
解决方法 |
1.柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。) |
1.控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器 |
2.流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。) |
2.使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。 |
3.流通池被污染或有气体 |
3.用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸) |
4.检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线) |
4.取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。 |
5.流动相配比不当或流速变化 |
5.更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。 |
6.柱平衡慢,特别是流动相发生变化时 |
6.用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。 |
7.流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。 |
7.检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。 |
8.样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。 |
8.使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。 |
9.使用循环溶剂,但检测器未调整。 |
9.重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。 |
10.检测器没有设定在最大吸收波长处。 |
10.将波长调整至最大吸收波长处。 |
M.基线噪音(规则的)
原因 |
解决方法 |
1.在流动相、检测器或泵中有空气。 |
1.流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。 |
2.漏液。
|
2.见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封。 |
3.流动相混合不完全。 |
3.用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 |
4.温度影响(柱温过高,检测器未加热)。 |
4.减少差异或加上热交换器。 |
5.在同一条线上有其他电子设备。 |
5.断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。 |
6.泵振动。 |
6.在系统中加入脉冲阻尼器。 |
N.基线噪音(不规则的)
原因 |
解决方法 |
1、 漏液
|
1.见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。 |
2.流动相污染、变质或由低质溶剂配成 |
2.检查流动相的组成。 |
3.流动相各溶剂不相溶 |
3.选择互溶的流动相 |
4.检测器/记录仪电子元件的问题 |
4.断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。 |
5.系统内有气泡 |
5.用强极性溶液清洗系统 |
6.检测器内有气泡 |
6.清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器 |
7.流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。) |
7.用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池 |
8.检测器灯能量不足 |
8.更换灯 |
9.色谱柱填料流失或阻塞 |
9.更换色谱柱 |
10.流动相混合不均匀或混合器工作不正常 |
10.维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置 |
O.宽峰
原因 |
解决方法 |
1.流动相组成变化 |
1.重新制备新的流动相 |
2.流动相流速太低 |
2.调节流速 |
3.漏液(特别是在柱子和检测器之间) |
3.见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。 |
4.检测器设定不正确 |
4.调整设定 |
5.柱外效应影响 a、柱子过载 b.检测器对反应时间或池体积响应过大 c.柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大 d.记录仪响应时间太长 |
5、 a、小体积进样(例如:10μL而不是100μL)以1:10或1:100的比例稀释样品 b、减少响应时间或使用更小的流通池 c、使用内径为0.007-0.01的短管路 d、减少响应时间 |
6.缓冲液浓度太低 |
6.增加浓度 |
7.保护柱污染或失效 |
7.更换保护柱 |
8.色谱柱污染或失效,塔板数较低 |
8.更换同样类型的色谱柱,如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。 |
9.柱入口塌陷 |
9.打开柱入口,填补塌陷或更换柱子 |
10.呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰 |
10.选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 |
11.柱温过低 |
11.提高柱温,除非特殊情况,温度不宜超过75℃ |
12.检测器时间常数太大 |
12.使用较小的时间常数 |
P.分离度降低
原因 |
解决方法 |
1.流动相污染或变质(引起保留时间变化) |
1.重新配置流动相 |
2.保护柱或分析柱阻塞
|
2.去掉保护柱进行分析,如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。 |
Q.所有的峰面积都太小
原因 |
解决方法 |
1.检测器衰减设定过高 |
1.减少衰减的设定 |
2.检测器时间常数设定太大 |
2.设定较小的时间常数 |
3.进样量太少 |
3.增大进样量 |
4.记录仪连接不当 |
4.使用正确的连接 |
R.所有的峰面积都太大
原因 |
解决方法 |
1.检测器衰减设定过低 |
1.采取较大的衰减 |
2.进样过多 |
2.减少进样量 |
3.记录仪连接不正确 |
3.正确连接记录仪 |
A.手动进样阀,转动不灵
原因 |
解决方法 |
1.转子密封损坏 |
1.更换或调整转子密封 |
2.转子太紧 |
2.调整转子的松紧度 |
B.手动进样阀,载样困难
原因 |
解决方法 |
1.进样阀安装不当 |
1.重新安装 |
2.定量环阻塞 |
2.清洗或更换定量环 |
3.进样器污染 |
3.清洗或更换进样器 |
4.管路阻塞 |
4.清洗或更换管路 |
C.自动进样阀,不能转动
原因 |
解决方法 |
1.无压力(或电源) |
1.提供恰当的压力(电源) |
2.转子太紧 |
2.调整转子的松紧度 |
3.进样阀安装不当 |
3.重新安装 |
D.自动进样阀,其它问题
原因 |
解决方法 |
1.阻塞 |
1.清洗或更换阻塞部件 |
2.机械故障 |
2.见随机维修手册 |
3.控制器故障 |
3.维修或更换控制器 |
你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如,在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。
A.溶剂的气味
原因 |
解决方法 |
1.漏液 |
1.见section 3 |
2.溅出 |
a.检查废液瓶是否已满 b.找到溅出的部位并清洗干净 |
B.热气味
原因 |
解决方法 |
1.仪器过热 |
a.检查并调节通风设施 b.检查并调节温度设定 c.关掉仪器,查找维修手册 |
C.读数不正常
原因 |
解决方法 |
1.压力不正常 |
1.见section 2 |
2.柱温箱问题 |
2. a.检查并调节设定 b.参照用户手册 |
3.检测器灯失效 |
3.更换灯 |
D.灯警告
原因 |
解决方法 |
1.压力超出极限值 |
1. A a.检查是否阻塞 b.检查并调节极限值的设定 |
2.其它警示灯 |
2.见用户手册 |
E.警告音
原因 |
解决方法 |
1.溶剂泄漏/溅出 |
1.找到并解决 |
2.其它警告音 |
2.见用户手册 |
F.刺耳的短音或长音
原因 |
解决方法 |
1.轴承失效 |
1.见用户手册 |
2.润滑不够 |
2.进行恰当的润滑 |
3.机械故障 |
3.见用户手册 |
下表中列出了液相色谱常见的一些问题,右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。
A.溶剂瓶
问题 |
维护 |
1.进口筛板阻塞; |
1. a.更换(3-6个月) ab、b.过滤流动相,0.5μ滤膜 |
2.气泡; |
2.流动相脱气; |
B.泵
问题 |
维护 |
1.气泡; |
1.流动相脱气; |
2.泵密封损坏; |
2.更换(3个月); |
3.单向阀损坏; |
3.过滤流动相,运用在线过滤,准备备用单向阀; |
C.进样阀
问题 |
维护 |
1.转子密封损坏 |
1. a.不要拧的过紧 b.过滤样品 |
D.色谱柱
问题 |
维护 |
1.筛板阻塞 |
1. a.过滤流动相 b.过滤样品 c.运用在线过滤或保护柱 |
2.柱头塌陷 |
2. a.避免使用pH>8的流动相(针对大部分硅胶的柱子); b.使用保护柱; c.使用预柱(饱和色谱柱); |
E.检测器
问题 |
维护 |
1.灯失效,检测器响应降低,噪音增大 |
1.更换(6个月)或准备备用灯 |
2.流通池有气泡 |
2. a.保持流通池清洁 b.池后使用反压抑制器 c.流动相脱气 |
F.一般
问题 |
维护 |
1.腐蚀/摩擦损坏 |
1.在不使用时保持系统缓冲液的清洁 |
(文章来源:百度文库)
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