郑丹婷 苑子涵 崔佳燕 蔡思敏 韩 伟
华东理工大学中药现代化工程中心
上海 200237
摘 要：以总多糖得率为指标，采用超声辅助纤维素酶法提取灵芝子实体粉末中的多糖类化合物。在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合法对灵芝多糖的提取条件进行了优化，得到最优提取工艺条件：超声提取时间28 min、料液比1:36、酶解时间68min，在此条件下，灵芝多糖的得率为7.57%。
关键词：灵芝多糖；超声提取；纤维素酶；Box-Behnken法
0 引言
灵芝（Ganoderma LucidumKarst），又称“林中灵”，是孔菌科真菌灵芝的子实体[1]。2015年版《中国药典》收录有赤芝与紫芝两个品种。作为具有数千年药用历史的中国传统药材，灵芝具有很高的药用价值。现代药理学研究也证实，其具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、保肝、提高耐缺氧能力等功效[2]。
灵芝多糖（Ganoderma LucidumPolysaccharide）是多孔菌科灵芝属真菌菌丝体的次生代谢产物，存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中，具有清除体内自由基、提高机体免疫力、降血糖[3]等功效，被认为是灵芝扶正固本的根本[4]。
灵芝多糖存在于灵芝子实体的细胞壁内壁，而子实体结构致密，在提取过程中的传质阻力比较大，且灵芝多糖的相对分子量很大，传统的提取方法主要依靠的是扩散原理[5]，因此提取效率较低。超声提取法是一种利用超声波的空化作用、机械作用和热效应等加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解，以此显著提高提取效率的提取方法[6]。酶法提取是一种利用酶解作用，破坏细胞壁结构，以强化胞内有效成分扩散至胞外的传质过程，从而能够最大限度地提高中药有效成分得率的方法。
本文以总多糖得率为指标，采用超声辅助纤维素酶法提取灵芝中的多糖类化合物，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合法（以下简称Box-Behnken法）对提取工艺进行优化，以期为灵芝多糖的工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灵芝子实体，购于上海雷允上药店；纤维素酶（活性≥400 U/mg），上海瑞永生物科技有限公司；浓硫酸、苯酚、葡萄糖（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
试验所用仪器设备如表1所示。
1.3 试验方法
1.3.1 总多糖的测定
（1）葡萄糖标准品的配制：精密称取已干燥至恒重的无水葡萄糖20 mg，置于100 mL容量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀溶解，即得0.2 g/L的葡萄糖溶液。
（2）最大吸收波长的测定：精密量取葡萄糖标准品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加1 mL 5%的苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸溶液，放置10 min，于40℃水浴中保温30 min，取出，放至室温，加去离子水定容至10mL，摇匀，室温下按照紫外-可见分光光度法在400～600 nm波长范围内扫描，发现在490 nm处有最大吸收峰，故选择490 nm作为本试验的检测波长。
（3）标准曲线的绘制：分别取上述葡萄糖标准品溶液0.0 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加1 mL 5%的苯酚溶液，摇匀后迅速加入5 mL浓硫酸溶液，放置10 min，于40℃水浴中保温30 min，取出，放至室温，加去离子水定容至10mL，摇匀，以第一份溶液为空白溶液，按紫外-可见分光光度法，在490nm波长处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线的回归方程：A=4.209 6C-0.002 3，R2=0.993 2。
1.3.2 总多糖的单因素提取试验
将灵芝的子实体干燥至恒重，用粉碎机粉碎，装袋于阴凉处备用。精确称取灵芝子实体粉末2 g于圆底烧瓶中，按料液比1:20、1:25、1:30、1:35和1:40加入去离子水搅拌均匀，在一定温度（25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和60 ℃）下超声提取一段时间（15min、20 min、25 min、30 min和35 min）后，加入40mg纤维素酶，在一定温度下（25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃）水浴保温一定时间（30 min、40 min、50 min、60 min和70 min）后，迅速升温至90 ℃，灭活10 min，自然冷却后，抽滤，得到灵芝多糖提取液。用去离子水于容量瓶中将提取液定容至100 mL，摇匀后精密吸取稀释液1 mL，置于10 mL容量瓶中，在490 nm波长处测定吸光度A。
1.3.3 总多糖得率的测定
根据标准曲线回归方程，按以下公式计算总多糖的得率：
1.3.4 Box-Behnken响应面设计试验
在单因素试验基础上，选择对多糖得率影响较大的因素，采用四因素三水平的Box-Behnken中心组合试验设计方法（简称BBD），以料液比（X1）、超声时间（X2）、酶解时间（X3）和酶解温度（X4）为变量，每个变量分别以-1、0、+1表示，设计29个试验点的三次回归组合试验，确定提取的最佳工艺条件，Box-Behnken响应面试验设计如表2所示。
2 结果与讨论
2.1 灵芝总多糖提取的单因素试验
2.1.1 料液比
料液比是影响中草药中有效成分得率的主要因素之一，在其他条件固定的情况下，分别考察料液比为1:20、1:25、1:30、1:35和1:40时的灵芝多糖提取得率，结果如图1所示。
由图1可以看出，当料液比低于1:30时，随着料液比的增大，多糖得率大幅度提高；当料液比高于1:30后，随着料液比的增大，多糖得率增加缓慢；当料液比大于1:35后，多糖得率反而降低。这可能是由于溶剂过多，对后续的过滤、转移等操作要求过高，造成了一定的损失。因此，本试验选择1:35为最佳料液比。
2.1.2 超声提取时间
固定灵芝子实体粉末用量、料液比、超声温度等条件，分别考察超声提取时间为15 min、20 min、25 min、30 min和35 min时的灵芝多糖得率，结果如图2所示。
由图2可以看出，多糖得率随超声时间的增加而不断增大，在25 min时达到最高值，这是由于随着超声时间的不断增加，细胞壁的破碎程度不断增大，细胞内的多糖类物质更容易向外扩散，充分溶解到周围的溶剂中去；25 min后，随着超声时间的增加，多糖得率反而下降，可能是由于在长时间的超声波机械作用下，多糖结构遭到破坏，导致部分多糖降解，致使得率降低[7]。因此，本试验确定最佳超声时间为25min。
2.1.3 超声提取温度
固定料液比和超声提取时间等试验条件，考察超声提取温度为25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃和60 ℃时的灵芝多糖得率，结果如图3所示。
由图3可以看出，当超声提取温度小于55 ℃时，多糖得率随超声提取温度的升高而增大，至55 ℃时得率达到最大值。当超声提取温度大于55 ℃时，多糖得率随温度的升高反而降低，可能是由于温度的升高导致多糖降解。因此，本试验确定超声提取温度控制在55 ℃为宜。
2.1.4 酶解温度
称取灵芝子实体粉末2.0 g，在已确定料液比1:35、超声提取时间25 min以及超声温度55 ℃的条件下，固定酶解时间为30 min，考察酶解温度为25 ℃、35℃、45 ℃、55 ℃和65 ℃时的灵芝多糖得率，结果如图4所示。
从图4可以看出，随着酶解温度的升高，多糖得率不断增大，至55 ℃达到最大值；55 ℃后，多糖得率随着温度的升高反而降低，可能是因为随着温度的不断升高，酶的反应速率不断增加，但温度过高和过低都会对酶的活性造成影响。因此，本试验确定55 ℃为最佳酶解温度。
2.1.5 酶解时间
称取2.0 g灵芝子实体粉末，按料液比1:35加入去离子水70 mL，于55 ℃条件下超声提取25min后，加入40 mg纤维素酶，控制酶解温度为55 ℃，考察酶解时间为30～70 min时的灵芝多糖得率，结果如图5所示。
从图5可以看出，多糖得率随酶解时间的增加而不断增大，60 min时达到最大值，之后随着酶解时间的增加，得率不断降低，可能是由于酶解时间过短，酶促反应不完全，而酶解时间过长会导致多糖结构遭到破坏，得率反而降低[8]。因此，本试验确定最佳的酶解时间为60min。
2.2 单因素试验的方差分析
由2.1可知，每个因素对多糖得率均有影响，且影响程度各不相同。为减少BBD优化试验的试验次数，降低操作难度，提高优化效率，现对单因素试验的试验结果进行方差分析，结果如表3所示。
一般而言，方差数值越低，表明对应的试验结果波动越小，即该因素对试验结果的影响越不明显[9]。由表3可知，各因素对总多糖得率影响程度的大小依次为：酶解时间＞料液比＞酶解温度＞超声提取时间＞超声提取温度。故在后续的BBD法优化试验中，选择酶解时间、料液比、酶解温度和超声提取时间这四个因素进行优化。
2.3 Box-Behnken法设计优化试验
2.3.1 数学模型的建立与显著性检验
在单因素试验的基础上，选取影响显著的因素，即料液比、超声时间、酶解时间及酶解温度为自变量，灵芝总多糖得率为因变量，BBD优化试验设计及结果如表4所示。
分析表4中的各变量对灵芝总多糖得率的影响效果，通过多元回归拟合，可获得多糖得率与自变量料液比、超声时间、酶解时间、酶解温度的编码回归方程：Y=6.06+0.059X1-0.033X2+0.13X3+0.19X4+0.11X1X2+0.58X1X3+0.21X1X4+0.34X2X3+0.28X2X4+1.91X3X4+0.12X12+0.63X22-1.34X32-0.18X42-0.77X12X3-0.59X12X4。
回归模型的方差分析如表5所示。
从表5可以看出，回归模型极显著（P＜0.01），而误差项结果不显著，说明回归方程与实际情况拟合良好，可用此模型对试验结果进行分析和预测。显著性检验表明，各因素对响应值的影响由强到弱依次为：酶解时间（X4）、酶解温度（X3）、料液比（X1）和超声提取时间（X2）。回归模型的可信度分析如表6所示，复相关系数R2=0.9162（＞0.80），说明预测值与实测值之间具有高度的相关性，即该模型可以解释0.916 2的响应值的变化[10]。
2.3.2 Box-Behnken法组合优化结果
在各试验因素的取值范围内，利用Design-Expert（Version 8.0.6）软件预测最优的灵芝多糖提取条件为：超声提取时间27.82 min、料液比1:36.22、酶解时间68.24 min、酶解温度64.13 ℃。为便于实际操作，最优的提取条件修正为：超声提取时间28 min、料液比1:36、酶解时间68 min、酶解温度64 ℃。在最优提取条件下，灵芝多糖的理论得率为7.34%。依据调整后的提取条件进行操作，重复3次，得到的灵芝多糖得率为7.57%，实际测定值与理论值相接近，说明该拟合模型与实际情况拟合良好。
3 结语
（1）采用超声辅助酶法提取灵芝多糖，在单因素试验的基础上，选取对灵芝多糖得率影响较大的四个因素（料液比、超声提取时间、酶解温度和酶解时间），用Box-Behnken法对试验条件进行优化，得到拟合方程为：Y=6.06+0.059X1-0.033X2+0.13X3+0.19X4+0.11X1X2+0.58X1X3+0.21X1X4+0.34X2X3+0.28X2X4+1.91X3X4+0.12X12+0.63X22-1.34X32-0.18X42-0.77X12X3-0.59X12X4，回归方程与实际情况拟合良好。
（2）超声辅助酶法提取灵芝多糖的最优工艺条件为：超声提取时间28 min、料液比1:36、酶解时间68 min、酶解温度64 ℃，灵芝多糖理论得率为7.34%，依据最优化提取条件重复提取3次，灵芝多糖的实际得率为7.57%，实际值与理论值拟合良好，且提取工艺简便，条件温和，提取过程安全无污染，与传统的提取方法相比，该方法提取时间短，得率高，可以用于灵芝多糖的工业化生产。
[参考文献]
[1] 弓晓峰.黑灵芝元素形态、活性成分及其保健功能研究[D].南昌：南昌大学，2006.
[2] 陈伟，马飞，张琳，等.灵芝有效成分提取及药理活性研究进展[J].安徽农业科学，2016，44（8）：147-149.
[3] 王波.灵芝多糖提取、分离纯化、表征及体外抗氧化活性探究[D].郑州：郑州大学，2016.
[4] YANGZ, CHEN C, ZHAO J, et al. Hypoglycemic mechanism of a novel proteoglycan,extracted from Ganoderma lucidum in hepatocytes[J]. European Journal ofPharmacology, 2017, 820:77-85.
[5] 杨俊红，郭锦棠，朱养妮，等.中草药的不同提取方法与强化传质机理研究[J].化工进展，2002，21（9）：660-662.
[6] 袁丽娜，金晟君.黄酮类化合物的提取分离纯化研究进展[J].黑龙江科技信息，2013，21（4）：55.
[7] 吴先辉.苦瓜多糖超声波提取工艺的研究[J].长江蔬菜，2009（24）：42-44.
[8] 刘成程.高吸水性玉米多孔淀粉的制备及其生物相容性和止血效果的研究[D].西安：西北大学，2010.
[9] 施昶，黄海飞，李梦园，等.微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化[J].生物加工过程，2017，15（1）：43-48.
[10]罗文锋，韩伟.Box-Behnken试验设计-响应面优化金针菇多糖的工艺[J].南京工业大学学报（自然科学版），2016，38（4）：95-100.
基金项目：
国家大学生创新创业训练计划资助项目（201610251033）
作者简介：
郑丹婷（1995—），女，吉林长春人
研究方向：
制药工程与技术
通讯作者：
韩伟（1968—），男，江苏扬州人，博士，教授，从事中药制药工程、药物分离工程的研究工作
