AASLD2015：乙型肝炎治疗有望进入RNA干扰时代
慢性乙型肝炎至今尚未找到彻底治愈的药物，严重威胁着人类的健康。近年来，很多学者正努力寻找抗HBV新策略。通过多年的积累，人们逐渐发现隐藏在宿主细胞内的HBV cccDNA是病毒赖以复制生存的关键。
慢性乙型肝炎至今尚未找到彻底治愈的药物，严重威胁着人类的健康。近年来，很多学者正努力寻找抗HBV新策略。通过多年的积累，人们逐渐发现隐藏在宿主细胞内的HBV cccDNA是病毒赖以复制生存的关键。本届AASLD年会上，经过学术评议委员会的严格筛选，AASLD评选出了本年度关于“乙型肝炎新治疗和新靶点”的6项重要研究，RNA干扰技术的应用已占据了半壁江山。令人惊讶的是，本届AASLD主席Gyongyi Szabo女士特别邀请到RNA干扰技术之父、2006年诺贝尔生理学/医学奖得主——Craig C. Mello教授做主旨报告，相信这并非纯粹的巧合。目前，这些RNA干扰药物都取得了较好的临床前研究结果，期待在不久的未来，这一新型抗HBV药物将彻底解决慢性乙型肝炎这一难题。RNA干扰药物ARC-520在动物模型中可有效降低cccDNA水平ARC-520是以全部cccDNA的转录为靶点的RNA干扰性药物。前期的研究表明，HBV感染患者应用单剂ARC-520治疗后，病毒抗原水平可持续降低1个月以上。美国Arrowhead研究公司Wooddell等在AASLD年会上报告了应用多剂ARC-520对HBV感染黑猩猩肝脏HBV DNA和RNA的效果
Wooddell博士介绍说：“我们在9只HBV感染的黑猩猩（5只雄性，4只雌性）中观察了ARC-520治疗（每月1次，共6~11次）的效果。HBeAg阳性组（n=5）与阴性组（n=4）的基线血清DNA分别为为8~9 log IU/mL和≤3 log IU/mL。在给予ARC-520之前，均应用NA治疗8~24周。”
在基线、完成NA导入和ARC-520治疗后进行肝活检，应用qPCR检测HBV DNA和cccDNA，应用RT-qPCR检测前核心/核心RNA（C探针）和总HBV RNA（总探针）。
目前的研究表明：?①应用核苷（酸）类似物（NA）治疗的HBeAg阳性黑猩猩加用ARC-520后，可使肝脏总DNA和cccDNA水平进一步降低；②ARC-520可使HBV RNA和抗原减少，而NA无法实现；③对于慢性HBV感染者，尤其是HBeAg阴性者，HBV DNA整合是HBsAg持续阳性的重要原因。鲁凤民教授：CRISPR/Cas9系统及RNAi方法可促使cccDNA清除我国北京大学医学部病原生物学系鲁凤民教授课题组利用RNA干扰技术设计出一种新型基因组编辑工具CRISPR/Cas9系统，它可有效破坏HBV表达模板，且无明显的细胞毒性。这项研究在今年的8月28日，已发表在World J Gastroenterol杂志上。研究人员总共设计出了对抗HBV A-D基因型的15种gRNAs，选出了覆盖HBV调控区域的11个双gRNAs组合。结果显示所有gRNAs都可以显著减少培养物上清液中HBsAg或HBeAg生成，这取决于gRNA对抗的区域。所有的双gRNAs都可以有效抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，与单gRNA相比，双gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通过PCR直接测序技术，他们证实了这些双gRNAs可通过除去两gRNAs切割位点之间的片段来破坏HBV表达模板。更重要的是，gRNA-5和 gRNA-12组合不仅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，还能够破坏HepAD38细胞中的cccDNA储存库。鲁凤民教授表示：“我们的研究表明，CRISPR/Cas9系统可以有效破坏HBV表达模板，并且有很好的安全性。它可能成为根除慢性HBV感染患者中持续存在的HBVcccDNA的一种有效手段。”以HBV基因组为靶点的RNA干扰，有望通过有效降低所有病毒基因产物，包括HBsAg等病毒抗原的表达，实现HBV感染的“功能性治愈”。美国Alnylam制药公司Sepp-Lorenzino等的研究表明，针对肝细胞的siRNA偶联物—ALN-HBV以HBV基因组内的高度保守区为靶点，可介导特异、强力和持久的HBV病毒转录沉默和HBsAg表达沉默。
ALN-HBV是一种化学稳定性增强、针对肝细胞的GalNAc-siRNA偶联物，其靶点为HBV X蛋白开放阅读框（ORF）的一个位点，因此，可针对所有四种HBV RNA转录体，通过RNA干扰发挥降解作用。生物信息学分析表明，它与合并A-J基因型HBV的全长病毒基因组的序列同源性>95%，对宿主基因的脱靶活性非常低。在AAV-HBV小鼠模型中，以3 mg/kg单次皮下注射ANL-HBV后10~15天，血浆HBsAg平均下降1.6 log IU/mL（最多下降3.6 log IU/mL），在每周一次3 mg/kg治疗3次后，平均HBsAg沉默>2.9 log IU/mL，HBsAg低于定量水平（<0.05 ng/mL），在最后一剂后，HBsAg沉默持续超过100天。此外，在大鼠药代动力学和肝脏暴露的研究结果显示有良好的耐受性。目前，研究者正在进行其他药理学研究，包括ALN-PDL的联合研究，PDL是针对肝细胞内PD-L1的一种RNA干扰药物，ALN-PDL有望增强肝内的HBV特异性细胞免疫，从而提高局部对HBV感染的免疫控制，同时避免全身免疫检查点阻断的免疫毒性。病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNA干扰（RNAi）的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉默。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。2.RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；3.RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；4.RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；5.dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；6.ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
}
